淀粉酶活性測定

谷物種子萌發(fā)時(shí)淀粉酶活力的測定幾乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌發(fā)的禾谷類種子，淀粉酶活性最強(qiáng)。主要是a-淀粉酶和8-淀粉酶。種子萌發(fā)時(shí)，淀粉酶活性隨萌發(fā)時(shí)間迅速增加，將淀粉分解成小分子糖類，供幼苗生長。a-淀粉酶隨機(jī)水解淀粉的a-1，4-糖苷鍵，作為淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解產(chǎn)物為麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原性糖；8-淀粉酶水解非還原端的第二個(gè)a-1，4-糖苷鍵，水解產(chǎn)物為麥芽糖，并能使一部分糊精糖化。本實(shí)驗(yàn)以萌發(fā)種子為材料，測定其中a-淀粉酶和8-淀粉酶活性的差異。【原理】兩種淀粉酶具有不同理化特性，a-淀粉酶不耐酸，在PH36以下迅速鈍化；8-淀粉酶不耐熱，在70°C下15Min則被鈍化。據(jù)此，在測定時(shí)鈍化其中之一，就可以測定出另一種酶的活力，本實(shí)驗(yàn)采用加熱鈍化8-淀粉酶測出a-淀粉酶活力，再與非鈍化條件下測得的總淀粉酶活力比較，求出8-淀粉酶活力。淀粉的水解產(chǎn)物麥芽糖及其他還原性糖能與3,5-二硝基水楊酸試劑反應(yīng)，使其還原生成紅色3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與淀粉酶水解產(chǎn)物的濃度成正比，可用麥芽糖(或葡萄糖)濃度表示，用比色法測定淀粉生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力?！緝x器與用具】分光光度計(jì)；離心機(jī)；恒溫水浴器；研缽；具塞刻度試管25M113支，刻度吸管1ml、2ml、5M1各1支；容量瓶50M12支?！驹噭葵溠刻菢?biāo)準(zhǔn)液(1Mg/M1)：稱取100Mg麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至100M1。DNS試劑（3,5-二硝基水楊酸）：精確稱取3,5-二硝基水楊酸1g,溶于20Ml2Mol/LNAOH溶液中，加入50M1蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100M1。蓋緊瓶塞，勿使CO2進(jìn)入。若溶液混濁，可過濾后使用。01Mo1/LPH56的檸檬酸緩沖液：A液（01Mo1/L檸檬酸）：稱取分析純檸檬酸2101g，用蒸餾水溶解并定容至1L；B液（01Mol/L檸檬酸鈉）：稱取檸檬酸鈉2941g用蒸餾水溶解并定容至1L；取A液55Ml與B液145Ml混勻，即為01Mol/LPH56的檸檬酸緩沖液。%淀粉溶液：稱取1g淀粉溶于100Ml01Mol/LPH5 6的檸檬酸緩沖液中?！痉椒ā?.酶液提取稱取25°C下萌發(fā)3?4天的小麥種子1 0g（芽長1 0?15CM），置研缽中，加少量石英砂和2Ml蒸餾水，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，用7Ml蒸餾水分次將殘?jiān)慈腚x心管，提取液在室溫下放置提取15?20Min，每隔數(shù)分鐘攪動(dòng)1次，使其充分提取。然后在3000r/Min轉(zhuǎn)速下離心10Min，將上清液倒入50Ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5Ml，放入50Ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度搖勻，即為淀粉酶稀釋液。2麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取7支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按表18-1加入試劑：表18-1制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線配方表試劑管號(hào)1234567麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.20.40.81.21.62.0蒸餾水（ml）2.01.81.61.20.80.40麥芽糖含量（mg）00.20.40.81.21.62.03,5-二硝基水楊酸（ml）2222222搖勻，置沸水浴中煮沸5Min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20Ml。以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在540nM波長下比色測定。以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3酶活力的測定取6支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按表18-2進(jìn)行操作。表18-2酶活力的測定配方表操作項(xiàng)目管號(hào)I-11-21-311-111-211-3淀粉酶原液(ml)1.01.01.0000鈍化。-淀粉酶置70°C水浴中15Min,取出后在流水中冷卻淀粉酶稀釋液(ml)000111DNS試劑(ml)2.0002.000預(yù)保溫40C恒溫水浴中保溫10Min1%淀粉溶液(ml)(40C)1.01.01.01.01.01.0保溫40C恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫5MinDNS試劑(ml)02.02.002.02.0搖勻，置沸水浴中5Min，取出后冷卻，加蒸餾水至20M1，搖勻，在540nM波長下比色，記錄測定結(jié)果。4結(jié)果計(jì)算用I-2、I-3吸光度平均值與I-1吸光度值之差，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量(Mg)，再按下式計(jì)算a-淀粉酶的活力(Aa)，淀粉酶活性以每克鮮重所含麥芽糖毫克數(shù)(Mg/g?Min)表示：Aa=CaVTFWXtXV1(18-1)11-2、n-3吸光度平均值與II-1吸光度值之差，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量(Mg)，按式18-1計(jì)算(a+8)-淀粉酶的活性ATAT=CTXVTFWXtXV1式中A:淀粉酶活性，Aa為a-淀粉酶的活性，AT為淀粉酶總活性，主要是a、8-淀粉酶的活性；Ca:a-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖量(查標(biāo)準(zhǔn)曲線求值，以下同)；CT:(a+8)淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量；V1:顯色所用酶液體積(Ml)；T:酶作用時(shí)間(Min)；VT:樣品稀釋液總體積(a-淀粉酶為50M