生物化學(xué) 蛋白質(zhì)分離純化 張洪淵

一、一般原則及基本步驟材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)的抽提蛋白質(zhì)的粗分級(jí)等電點(diǎn)沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)凝膠層析法離子交換層析法親和層析

第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化與測(cè)定二、蛋白質(zhì)的分離純化方法

（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

（二）利用溶解度差別的純化方法

（三）根據(jù)電荷不同的純化方法

（四）利用選擇性吸附的純化方法

（五）利用配體的特異性親和力的純化方法

（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

1.透析和超濾

2.密度梯度離心

3.凝膠過(guò)濾1.透析和超濾半透膜袋蛋白質(zhì)溶液透析液磁棒磁力攪拌器

透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽單糖等分開(kāi)。常用的半透膜：

玻璃紙（賽璐玢紙，cellophanepaper）

火綿紙（賽璐玎紙,celloidinpaper）

其他改型纖維素材料超過(guò)濾（ultrafiltration）

利用壓力、抽濾（A）或離心力（B）等多種形式，強(qiáng)行使水和其它小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性的截留相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)。為了避免被膜截留的蛋白質(zhì)在膜表面上堆積，現(xiàn)常用截向流過(guò)濾的方法，即液體在泵驅(qū)動(dòng)下沿著與膜表面相切方向流動(dòng)，在膜上形成壓力，使部分液體透過(guò)膜，而另一部分液體切向地流過(guò)表面將被膜截留的蛋白質(zhì)分子沖走。濾膜抽氣濾膜離心AB2.密度梯度離心法（densitygradient）

生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個(gè)小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。滴加樣品離心管蔗糖密度梯度蔗糖濃度3.凝膠過(guò)濾

原理：凝膠層析也稱(chēng)為排阻凝膠層析、凝膠過(guò)濾和分子篩層析。它是60年代發(fā)展起來(lái)的，利用凝膠把物質(zhì)按分子大小不同進(jìn)行分離的一種方法。由于被分離物質(zhì)的分子大?。ㄖ睆剑┖托螤畈煌?，洗脫時(shí)，大分子物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動(dòng)，因此流程短，首先流出層析柱，而小分子物質(zhì)，由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，能自由進(jìn)出膠粒網(wǎng)孔，使之洗脫時(shí)流程增長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢而后流出層析柱。應(yīng)用測(cè)定分子量分子篩層析原理示意圖分子篩層析與洗脫曲線(xiàn)

凝膠顆粒收集蛋白質(zhì)管蛋白質(zhì)混合物大分子從柱上面加緩沖溶液小分子洗脫體積（Ve）凝膠柱大分子小分子Ve1Ve2V0蛋白質(zhì)Mr=49,000洗出液中的蛋白質(zhì)濃度洗脫體積（mL）未知logMr洗脫體積與相對(duì)分子質(zhì)量的關(guān)系

Andrews的經(jīng)驗(yàn)公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“選擇性曲線(xiàn)”G-200G-100logMrKav（二）利用溶解度差別的

純化方法

1.等電沉淀和PH控制

2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析

3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離

4.溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響1.等電沉淀和PH控制蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)。其他條件相同時(shí)，它的溶解度達(dá)到最低點(diǎn)。在等電點(diǎn)以上或以下的pH時(shí)，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號(hào)的凈電荷而相互排斥，阻止了單個(gè)分子聚集成沉淀，因此溶解度較大。在其等電點(diǎn)(pH5.2-5.3)時(shí)達(dá)到最低值，在等電點(diǎn)兩側(cè)的pH下，其溶解度迅速上升；不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開(kāi)。當(dāng)pH被調(diào)至蛋白質(zhì)混合物中某種成分的等電點(diǎn)pH時(shí)，這種蛋白質(zhì)的大部分或全部將沉淀下來(lái)，那些等電點(diǎn)高于或低于該pH的蛋白質(zhì)則仍留在溶液中這樣沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽溶(saltingin),鹽溶作用主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類(lèi)離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析過(guò)程中往往沉淀析出，這就是因?yàn)橥肝龀チ他}類(lèi)離子，使蛋白質(zhì)分子間的相互吸引增加，引起蛋白質(zhì)分子的凝集并沉淀。鹽析？3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離（1）有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)沉淀主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。（2）有機(jī)溶劑可以破壞水化膜、造成一個(gè)低介電區(qū)。（3）有分級(jí)分離現(xiàn)象（4）要求對(duì)有機(jī)溶劑低溫預(yù)冷。4.溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響在一定溫度范圍內(nèi)，約0-40℃之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加，但也有例外，例如人的血紅蛋白從0到25℃，溶解度隨溫度上升而降低。在40-50℃以上開(kāi)始變性，一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級(jí)分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進(jìn)行。（三）根據(jù)電荷不同的純化方法

1.電泳

2.聚丙烯酰胺凝膠電泳

3.毛細(xì)管電泳

4.等電聚焦

5.層析聚焦

6.離子交換層析1.電泳電泳分離蛋白質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移的差別達(dá)到分離目的的。蛋白質(zhì)樣品加到一塊預(yù)先制好的凝膠介質(zhì)上，只要在凝膠的兩端加上電場(chǎng)，就可以達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的，這樣的電泳稱(chēng)之凝膠電泳（gelelectrophoresis）。凝膠可以是淀粉凝膠（starchgel）、瓊脂糖凝膠（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）。一般凝膠介質(zhì)中的pH被維持在堿性區(qū)，目的是使大多數(shù)蛋白質(zhì)都帶有負(fù)電荷，這樣它們可以向陽(yáng)極遷移。蛋白質(zhì)的遷移與蛋白質(zhì)的質(zhì)量和帶電荷的多少有關(guān)。電泳技術(shù)分類(lèi)垂直板電泳毛細(xì)管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜圓盤(pán)電泳2.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,簡(jiǎn)稱(chēng)PAGE)，也稱(chēng)圓盤(pán)凝膠電泳或圓盤(pán)電泳(discgelelectrophoresis)，它是在區(qū)帶電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。它以聚丙烯Ift胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的二部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分是分離膠），這二部分凝膠的濃度（孔徑大?。?、緩沖液組分和離子強(qiáng)度,pH以及電場(chǎng)強(qiáng)度都是不同的，即不連續(xù)的。這樣,電泳時(shí)樣品首先在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶（厚度約為0.1mm），然后再進(jìn)行電泳分離。PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N

-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應(yīng)的催化系統(tǒng)有兩種?；瘜W(xué)聚合:催化劑過(guò)硫酸銨(AP)，加速劑TEMED光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED

不連續(xù)PAGE三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)3.毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳又稱(chēng)毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（

2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離，分離后的樣品依次通過(guò)設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測(cè)器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了快速和高效分離。毛細(xì)管電泳是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測(cè)定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。毛細(xì)管電泳原理示意圖毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展毛細(xì)管電泳分離模式的發(fā)展4.等電聚焦（isoelectricfocusing）原理:

在一定抗對(duì)流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過(guò)時(shí)，便形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過(guò)程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點(diǎn)得到分離。應(yīng)用：

高效率分離純化蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+線(xiàn)性梯度5.聚焦層析（Chromatofocusing）該法是在等電點(diǎn)聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點(diǎn)的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過(guò)程叫做聚焦效應(yīng)。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時(shí),由于洗脫液的連續(xù)流動(dòng)，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點(diǎn)相同的pH處。從此位置開(kāi)始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出。在聚焦層析過(guò)程中,一種樣品分次加入時(shí)，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的時(shí)間進(jìn)行聚焦,剩余樣品還可以加到柱上,其聚焦過(guò)程都能順利完成。pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動(dòng)速率層析時(shí)的聚焦效應(yīng)示意圖6.離子交換層析

（ion-changechromatography）

原理基質(zhì)疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應(yīng)用制備純化生物物質(zhì)定量、定性測(cè)定混合物中各組分1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度離子交換層析原理示意圖

蛋白質(zhì)濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管收集樣品的管帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)混合物玻璃柱帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管NaClNaCl梯度梯度混合器凝膠顆粒蛋白質(zhì)混合物大分子小分子儲(chǔ)液瓶混合瓶層析柱磁力攪拌器洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度簡(jiǎn)單型梯度混合器梯度洗脫曲線(xiàn)洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度儲(chǔ)液瓶混合瓶復(fù)合型梯度混合器梯度洗脫曲線(xiàn)凸形線(xiàn)形凹形常用的陽(yáng)離子交換劑

離子交換劑可電離基團(tuán)可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)CM-纖維素（弱酸型）羧甲基P-纖維素（中強(qiáng)弱酸型）磷酸基SE-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺乙基SP-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺丙基常用的陰離子交換劑

AE-纖維素（弱減型）氨基乙基離子交換劑可電離基團(tuán)可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)PAB-纖維素（弱減型）對(duì)氨基苯甲酸DEAE-纖維素二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex二乙基氨基乙基DEAE-纖維素（強(qiáng)減型）二乙基氨基乙基QAE-纖維素（強(qiáng)減型）二乙基（2-羥丙基）-氨基乙基（中弱減型）（中弱減型）（四）利用選擇性吸附的純化方法

1.羥磷灰石層析

2.疏水作用層析

某些稱(chēng)為吸附劑的固體物質(zhì)具有吸附能力，能夠?qū)⑵渌N類(lèi)的分子吸附在自己的表面，吸附力的強(qiáng)弱因被吸物質(zhì)的性質(zhì)而異。吸附過(guò)程涉及范德華相互作用和氫鍵這些非離子吸引力。吸附層析就是利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離目的的。典型的吸附劑有硅膠、氧化鋁和活性炭等。1.羥磷灰石層析吸附劑羥磷灰石即結(jié)晶磷酸鈣，它用于分離蛋白質(zhì)或核酸。羥磷灰石的吸附機(jī)制尚不完全清楚，但認(rèn)為與其表面上的鈣離子和磷酸根有關(guān)，涉及偶極-偶極相互作用，可能還有靜電吸引。據(jù)推測(cè)，蛋白質(zhì)中帶負(fù)電基團(tuán)與羥磷灰石晶體表面的鈣離子結(jié)合，而帶正電基團(tuán)與磷酸基相互作用。羥磷灰石層析最重要的用途之一是把單鏈DNA和雙鏈DNA分開(kāi)。羥磷灰石對(duì)雙鏈DNA親和力很大，以致用羥磷灰石層析能從含RNA和蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取液中選擇性地除去DNA羥磷灰石對(duì)蛋白質(zhì)的吸附容量比較大，在一般吸附條件下（底離子