改良式水楊醛比色法測定奶牛紅細胞膜上apase活性

改良式水楊醛比色法測定奶牛紅細胞膜上apase活性

近年來，我國奶牛酮病的發(fā)病率顯著增加，尤其是隱酮病，降低了牛奶產(chǎn)量，影響了奶牛業(yè)的發(fā)展。奶牛酮病是高產(chǎn)奶牛產(chǎn)犢后6周內(nèi)最常發(fā)生的一種以碳水化合物和揮發(fā)性脂酸代謝紊亂為基礎(chǔ)的營養(yǎng)代謝病。臨床表現(xiàn)為頑固性消化紊亂,產(chǎn)奶量下降,機體脫水和一定的神經(jīng)癥狀。臨床特征為酮血、酮尿、酮乳、低血糖、血漿游離脂肪酸濃度升高和肝糖元含量降低。為了進一步揭示奶牛酮病的發(fā)生機理,首次對奶牛酮病紅細胞膜上ATPase活性進行了測定,旨在為臨床防治奶牛酮病提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實驗動物黑龍江某牛場泌乳量在6.5×103kg以上的3～6胎荷斯坦奶牛。1.1.2儀器7230G分光光度計(上海第三分析儀器廠);低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);旋渦混勻器(上海第一醫(yī)學(xué)院儀器廠)。1.1.3試劑紅細胞膜上ATPase活性測定試劑盒,南京建成生物研究所;亞硝基鐵氰化鈉,無水碳酸鈉,硫酸銨(分析純),天津市化學(xué)試劑一廠。1.2方法1.2.1動物實驗應(yīng)用酮粉法和改良式水楊醛比色法對黑龍江某農(nóng)場的荷斯坦奶牛進行酮病抽樣檢測。分為兩組,每組10頭,分別為對照組和試驗組。1.2.2紅細胞沉淀和回血率于對照組和實驗組奶牛尾靜脈采取1mL肝素抗凝全血,測定紅細胞數(shù),然后加4倍左右的0.86%NaCl溶液,2000r/min離心10min,棄去上層血清,留紅細胞沉淀。在沉淀的紅細胞中加雙蒸水1.0mL反復(fù)混勻,使其充分溶血,直至溶液透亮,取0.2mL溶血液應(yīng)用試劑盒比色法測定紅細胞膜上ATPase活性。1.2.3數(shù)據(jù)處理和分析采用Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗。2結(jié)果2.1酮病陽性牛的診斷2.1.1乳中酮體的測定酮體的含量與實驗色澤反應(yīng)的快慢,深淺成正比,陰性反應(yīng)成土褐色,陽性結(jié)果以“+”表示,并代表乳中酮體的大約含量。陽性牛顯示有紫色跡象,并逐漸加深,于30s達頂點者為(++++),表示乳中約含酮體4.0mmol/L以上(圖1)。2.1.2楊樹業(yè)的比色法得以更好地診斷在酮粉法診斷結(jié)果的基礎(chǔ)上,進行改良式水楊醛比色法血清酮體含量的測定(表1),根據(jù)上述兩種方法選擇實驗牛。2.2紅膜上的apse活性試驗3不同類型的乳狀液對紅氧化酶活性的影響酮病的發(fā)病機理很復(fù)雜,但普遍接受的是糖缺乏理論。機體低血糖是產(chǎn)生酮病的關(guān)鍵。由于各種原因所致碳水化合物供應(yīng)不足及高泌乳消耗大量的糖,導(dǎo)致機體低血糖及能量負(fù)平衡。為此,動用體脂肪和體蛋白,補充能量的不足。但是,脂肪和蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生大量的游離脂肪酸和生酮氨基酸,經(jīng)肝臟的β-氧化為乙酰輔酶A,乙酰輔酶A可與草酰乙酸縮合成檸檬酸經(jīng)三羧酸循環(huán)氧化供能。如果生成草酰乙酸的先質(zhì)丙酸的碳水化合物不足,使得大量乙酰輔酶A不能進入三羧酸循環(huán),導(dǎo)致酮體蓄積,進而引起一系列的代謝與機能紊亂。臨床表現(xiàn)為消化型、神經(jīng)型和癱瘓型酮病。ATP酶存在于組織細胞及細胞器的膜上,是生物膜上的一種蛋白酶,它包括Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase4種,在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要的作用,機體在缺氧及某些病理情況下,此酶活性發(fā)生一系列改變。試驗結(jié)果表明,酮病陽性組與對照組相比,Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase活性均有程度不同的下降,并且差異顯著。從而說明奶牛酮病影響紅細胞膜上ATPase的活性變化。分析實驗結(jié)果可能有以下兩方面的原因:①酮病陽性牛的高酮血癥和低糖血癥導(dǎo)致動物機體缺氧,缺氧則導(dǎo)致ATPase活性降低;②酮病陽性牛早期的食欲下降和代謝紊亂,使血液中Na+、K+、Ca2+、Mg2+水平發(fā)生變化,進而影響Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase活性,表現(xiàn)程度不同的下降,尤其是神經(jīng)型酮病和癱瘓型酮病更為突出。另外,ATPase作為生物膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運和能量代謝的關(guān)鍵酶,