配種與人工授精技術(shù)

第四章配種與人工授精技術(shù)導(dǎo)言

配種是家畜繁殖的重要環(huán)節(jié)之一，母畜發(fā)情后應(yīng)適時(shí)配種。家畜配種的方法主要有自然交配和人工授精兩種。自然交配又叫本交，是指按照一定的公母比例，將公畜分散在母畜群中任其自由交配。人工授精則是人工利用器械采取公畜精液，經(jīng)過品質(zhì)檢查和適當(dāng)處理，再用器械將精液適時(shí)的輸送到母畜的生殖道內(nèi)，使其妊娠。人工授精配種的優(yōu)點(diǎn)是：可提高優(yōu)良公畜的利用率和母畜受胎率；預(yù)防疾病傳播；克服雜交改良和形體大小相差懸殊配種時(shí)的困難；打破母畜配種時(shí)間、地域、空間隔距，用于異地配種等。人工授精配種的程序包括采精、精液品質(zhì)檢查、處理、保存、運(yùn)輸和輸精等。本章主要講授：

1、采精

2、精液品質(zhì)檢查

3、精液處理

4、精液保存

5、輸精課題1采精

【目的要求】

1、了解采精的準(zhǔn)備過程

2、掌握家畜假陰道的組成、安裝及使用方法

3、熟悉牛、羊、豬的采精方法及家畜的采精頻率【內(nèi)容重點(diǎn)】

1、假陰道的安裝

2、假陰道采精方法和豬的拳握采精方法

3、各種家畜的采精頻率?！窘虒W(xué)方法】

實(shí)地操作教學(xué)【內(nèi)容講授】

一、采精前的準(zhǔn)備

（一）場地準(zhǔn)備：采精應(yīng)有專門的場地，要求寬敞明亮、平坦、清潔、安靜，靠近精液處理室，并設(shè)有采精架等設(shè)施。

（二）臺(tái)畜準(zhǔn)備：臺(tái)畜是供公畜爬跨的臺(tái)架，可以是真臺(tái)畜也可以是假臺(tái)畜。真臺(tái)畜一般為體格健壯、健康無病、性情溫順的發(fā)情母畜；假臺(tái)畜是用鋼筋、木料、橡塑制品、棉絮和同種畜皮制成的類母畜。

（三）假陰道準(zhǔn)備：假陰道是模仿母畜陰道的生理?xiàng)l件設(shè)計(jì)的一種采精工具。

各種家畜的假陰道外形、大小有所差異外，其組成基本相同。均由外殼、內(nèi)胎、集精杯（瓶、管）、活塞、固定膠圈構(gòu)成。用前需要安裝。（四）公畜準(zhǔn)備：公畜必須有良好的體況，充分的性興奮和性欲，無疾病和惡癖。在每次采精前，需徹底清洗公畜的陰莖和包皮。

（五）術(shù)者準(zhǔn)備：采精員應(yīng)技術(shù)熟練，動(dòng)作敏捷。操作前要求腳穿長筒膠靴，著緊身工作服，指甲剪短磨光，清洗消毒受臂。（六）假陰道安裝：

1、先檢查外殼和內(nèi)胎是否有裂口、破損、沙眼等。將內(nèi)胎的粗糙面朝外，光滑面朝里放入外殼內(nèi)，用內(nèi)卷法和外翻法將內(nèi)胎套在外殼上，用膠圈固定，要求松緊適度，不扭曲。

2、消毒：使用前半小時(shí)，用70％的酒精棉球由內(nèi)向外，對(duì)內(nèi)胎進(jìn)行涂抹消毒；待酒精氣味揮發(fā)后，用生理鹽水沖洗一遍即可使用。

3、灌水：由注水孔注入45℃左右的溫水，水量為內(nèi)外殼容量的2／3，蓋好膠塞。

4、涂油：用玻璃棒蘸取少量液體石蠟或凡士林，由里向外在內(nèi)胎上均勻涂抹，深度為外殼長度的1／2左右。

5、吹氣：由氣孔吹入氣體，并用調(diào)節(jié)閥調(diào)節(jié)假陰道內(nèi)的壓力，使假陰道入口處呈“糖三角”狀。

5、測溫：用水溫計(jì)測定假陰道中間部位的溫度，采精溫度為38－40℃。

二、采精方法

（一）假陰道采精法：采精時(shí)，采精員右手持假陰道蘸再臺(tái)畜的右后方，當(dāng)公畜爬跨臺(tái)畜的瞬間，迅速用左手托起陰莖，將其導(dǎo)入假陰道內(nèi)，公畜射精完畢后，使假陰道自然脫離陰莖，精液流入集精杯中，取下集精杯，送精液處理室處理。該方法適用于各種家畜的采精。（二）手握采精法：用于公豬的采精。方法是：采精員蹲在臺(tái)豬右側(cè)，當(dāng)公豬爬跨臺(tái)豬時(shí)，左手握成空拳，使公畜陰莖插入空拳內(nèi)，讓其自然轉(zhuǎn)動(dòng)片刻，再握緊陰莖的螺旋部不讓龜頭轉(zhuǎn)動(dòng)，；當(dāng)陰經(jīng)充分勃起后，順勢向前牽拉，手指有節(jié)奏的進(jìn)行彈性松握，引起公畜射精；右手持集精瓶收集精液。公豬射精約經(jīng)數(shù)10分鐘，并分3－4次射出，每次持續(xù)5－7分鐘；第一次射出的精液精子少，可不收集。（三）采精注意事項(xiàng)：

1、采精時(shí)，要注意安全，特別是大家畜采精。

2、善待公畜，不可施暴。

3、公牛、羊?qū)訇幍赖臏囟容^敏感，應(yīng)特別注意調(diào)溫；將陰莖導(dǎo)入假陰道時(shí)，且勿用手抓握陰莖；公牛、羊射精時(shí)間極短，只有幾秒鐘，當(dāng)公畜用力向前一沖時(shí)即表示射精，因此，要求采精者動(dòng)作迅速。

4、公馬、驢對(duì)假陰道的壓力更敏感，且陰莖在假陰道內(nèi)抽動(dòng)時(shí)間較長，故要固定好假陰道，并使假陰道入口端向陰莖方向傾斜施壓。當(dāng)公馬驢頭部下垂，啃咬臺(tái)畜鬐胛，臀部肌肉和肛門有節(jié)律顫抖時(shí)即表示射精，此時(shí)需使假陰道向集精杯方向傾斜，以免精液倒流。三、采精頻率

適宜的采精頻率是保障公畜生殖功能和身體健康的基本要求，也是獲得優(yōu)良精液的基礎(chǔ)。采精頻率應(yīng)根據(jù)公畜產(chǎn)生精子的數(shù)量來決定，各種家畜適宜的采精頻率如表9－1。表9－1各種家畜的采精頻率

畜別每次射精量(ml)每次射出精子總數(shù)(億個(gè))每周采精次數(shù)(次)每周射出精子總數(shù)(億個(gè)）牛6－1050－1502－4150－400綿羊0.8－1.216－367－25200－400山羊0.5－1.515－607－20250－350豬150－300300－6002－51000－1500馬30－100100－1502－6150－400驢20－8030－1002－6100－300兔0.5－2.03.0－7.02－66－42【復(fù)習(xí)思考題】

1、什麼叫人工授精？有何好處？

2、假陰道的結(jié)構(gòu)、安裝與要求

3、采精的方法

4、采精應(yīng)注意的問題

5、各種家畜的采精量課題2精液品質(zhì)的檢查【目的要求】

1．熟悉精液的基本特性及精液的外觀性狀檢查方法

2．熟悉精子活力的概念，熟練掌握精子活力的檢查方法，初步學(xué)會(huì)用“十級(jí)一分制”，評(píng)定精子活力

3．掌握用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢查精子的密度

4．明確出精子形態(tài)檢查的項(xiàng)目及意義?！緝?nèi)容重點(diǎn)】1、精液的外觀性狀檢查方法

2、精子活力的檢查方法

3、精子的密度的檢查方法。【內(nèi)容講授】

一、精液的外觀性狀檢查

1、采精量：采精后將精液盛裝在有刻度的試管或精液瓶中，可測出精液量的多少。豬和馬的精液應(yīng)用4-6層的消毒紗布過濾或離心處理，除去膠狀物質(zhì)。各種家畜的采精都有一定范圍，精液量與正常差異較大，應(yīng)查明原因，及時(shí)調(diào)整采精方法或?qū)筮M(jìn)行治療。

2、顏色：精液一般為乳白色或灰白色，精子密度越大，精液的顏色越深。牛、羊的精液呈乳白或厚乳白色，有時(shí)呈淡黃色。馬、豬的精液為淡乳白或灰白色。若精液呈紅色，說明混有鮮血。精液呈褐色，是混有陳血。精液呈淡黃色則是混有膿汁或尿液。顏色異常的精液應(yīng)廢棄，立即停止采精，查明原因，及時(shí)治療。

3、氣味：正常精液略帶有腥味，牛、羊精液除具有腥味外，另有微汗脂味。氣味異常往往伴有顏色的變化。

4、云霧狀：牛、羊的精液精密度大，放在玻璃容器中觀察，精液呈上下翻滾狀態(tài)，像云霧一樣。稱為云霧狀。這是精子運(yùn)動(dòng)活躍的表現(xiàn)。云霧狀明顯可用“+++”表示；較明顯用“++”表示；不明顯用“+”表示。

二、精子活力檢查

精子活力又稱活率，是指精液中作直線運(yùn)動(dòng)的精子占整個(gè)精子數(shù)的百分比?；盍κ蔷簷z查最重要指標(biāo)之一，在采精后、稀釋前后、保存和運(yùn)輸前后、輸精前都要進(jìn)行檢查。

(一)檢查方法檢查精子活力需借助顯微鏡，放大200－400倍，把精液樣品放在鏡下觀察。

1、平板壓片：取1滴精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，放在鏡下觀察。此法簡單、操方便，但精液易干燥，檢查應(yīng)從速。

2、懸滴法：取1滴精液于蓋玻片上，迅速翻轉(zhuǎn)使精液形成懸滴，置于凹玻片的凹窩內(nèi)，即制成懸滴玻片。此法精液較厚，檢查結(jié)果可能偏高。

(二)評(píng)定評(píng)定精子活力多采用“十級(jí)一分制”，如果精液中有80％的精子作直線運(yùn)動(dòng)，精子活力計(jì)為0.8；如有50％的精子作直線運(yùn)動(dòng)，活力計(jì)為0.5，以此類推。評(píng)定精子活力的準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)，具有主觀性，檢查時(shí)要多看幾個(gè)視野，取平均值。

牛、羊及豬精液的精子密度較大；為觀察方便，可用等滲溶液（如生理鹽水等）稀釋后再檢查。溫度對(duì)精子活力影響較大，為使評(píng)定結(jié)果準(zhǔn)確，要求檢查溫度在37℃左右，顯微鏡需有恒溫裝置。

三、精子的密度檢查

精子密度是指單位體積(1m)精液內(nèi)所含有精子的數(shù)目，是評(píng)定精液晶質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

1、估測法：估測法通常結(jié)合精子活力檢查來進(jìn)行。精子間的間隙小于一個(gè)精子長度為密；建系相當(dāng)于一個(gè)精子長度為中等；大于一個(gè)精子長度為稀。這種方法能大致估計(jì)精于的密度，主觀性強(qiáng)，誤差較大。

2、光電比色法：現(xiàn)世界各國普遍應(yīng)用于牛、羊精液的密度測定。此法快速、準(zhǔn)確、操作簡便。其原理是根據(jù)精掖的透光性，精于密度越大，透光性就越差。事先將原精液稀釋成不同倍數(shù)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算精于密度，從而制成精液密度標(biāo)準(zhǔn)管，然后用光電比色計(jì)測定其透光度，根據(jù)透光度求每相差1％透光度的級(jí)差精子數(shù)，編制成精子密度對(duì)照表備用。測定精液樣品時(shí)，將精液稀釋80－100倍，用光電比色計(jì)測定其透光值，查表即可得知精子密度。3、血細(xì)胞計(jì)數(shù)法：用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法定期對(duì)公畜的精液進(jìn)行檢查，可較準(zhǔn)確地測定精子密度。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中有一計(jì)算室和兩個(gè)稀釋用的吸管，紅細(xì)胞吸管能對(duì)精液進(jìn)行100或200倍稀釋，適合于牛、羊精液檢查；白細(xì)胞吸管能對(duì)精液進(jìn)行10或20倍稀釋，適合于豬和馬的精液檢。紅細(xì)胞計(jì)算板上的計(jì)算室的高度為0．1mm，邊長1mm，為一正方形，由25個(gè)中方格組成，每一中方格分為16個(gè)小方格。檢查時(shí)，用3％的NaCl對(duì)精液進(jìn)行稀釋并殺死精子。于顯微鏡下，從25個(gè)中方格中選取四角和中央5個(gè)計(jì)數(shù)，對(duì)于壓線的精子，以精子頭部為準(zhǔn)，采用“上計(jì)下不計(jì)，左計(jì)右不計(jì)”的方法計(jì)數(shù)，最后按公式進(jìn)行計(jì)算。公式是：

1ml原精液中的精子總數(shù)＝5個(gè)中方格內(nèi)精子數(shù)×5（25個(gè)中方格）×10（1mm3內(nèi)精子數(shù)）×1000（1ml=1000mm3）×稀釋倍數(shù)

四、精子的其它檢查

1、精子的畸形率檢查：凡形態(tài)和結(jié)構(gòu)不正常的精于都屬畸形精子。通常精子畸形率，牛、豬不超過18％，羊不超過14％；馬不超過12％。如果畸形精子超過20％則視為精液品質(zhì)不良，不能用做輸精。

2、精于頂體異常率檢查：精子頂體異常會(huì)導(dǎo)致受精障礙。頂體異常有膨脹、缺損、脫落等。當(dāng)精子頂體異常率超過14％，受精能力就會(huì)明顯下降。檢查精子頂體異常率的方法是：先把精液制成抹片，干燥后用95％的酒精固定，水洗后用姬姆薩液染色1.5－2小時(shí)，再水洗干燥，用樹脂封裝放在鏡下1000倍觀察，隨機(jī)觀察500個(gè)精子，計(jì)算頂體異常率。

3、精子生存時(shí)間和生存指數(shù)檢查：精子的生存時(shí)間和生存指數(shù)與受精能力有關(guān)，也是鑒定精液處理效果的一種方法。精子生存時(shí)間是指精子總的存活時(shí)間，檢查時(shí)將精液置于一定的溫度下，每隔8-12h檢查精子活力，直至無活動(dòng)精子為止。所有間隔時(shí)間累加后減去最后兩次間隔時(shí)間的一半即為精子的生存時(shí)間。生存指數(shù)是指相鄰兩次檢查的間隔時(shí)間與平均活力的乘積之和。精子生存時(shí)間越長，生存的指數(shù)越大，說明精子活力就強(qiáng)，精液晶質(zhì)好。

4、美藍(lán)褪色試驗(yàn)：美藍(lán)是一種氧化還原劑，氧化時(shí)呈藍(lán)色，還原時(shí)無色。精子在美藍(lán)溶液中呼吸時(shí)氧化脫氫，美藍(lán)被還原而褪色。因此，根據(jù)美藍(lán)溶液褪色時(shí)間的快慢可估測出精子的密度和活力。牛、羊精液美藍(lán)褪色試驗(yàn)的方法是：取含有0．01％美藍(lán)的生理鹽水與等量的原精液混合，置于載玻片上，然后用內(nèi)徑0.8－1.0mm、長6－8cm的毛玻璃管吸取，使液柱高達(dá)1.52cm以上、然后放在白紙上，在18－25℃的溫度下觀察并計(jì)時(shí)。牛羊精液褪色在10min、7min品質(zhì)良好；褪色時(shí)間在10—30min、8-12min為中等；30min、12min以上視為品質(zhì)較差?！緩?fù)習(xí)思考題】1、精液的外觀性狀檢查項(xiàng)目及方法2、精子活力檢查和精子密度檢查的方法3、精子的其它檢查項(xiàng)目課題3精液稀釋【目的要求】1、了解精液稀釋的目的。

2、熟悉稀釋液的成分及其作用。

3、掌握稀釋液的配制方法及注意事項(xiàng)。

4、能準(zhǔn)確地確定精液稀釋倍數(shù)。

5、能正確、規(guī)范地進(jìn)行精液稀釋?！緝?nèi)容重點(diǎn)】1、稀釋液的配制方法及注意事項(xiàng)。

2、確定精液稀釋倍數(shù)。

3、精液稀釋方法。【教學(xué)方法】結(jié)合實(shí)驗(yàn)室操作教學(xué)【內(nèi)容講授】

一、精液稀釋與目的精液稀釋是采精及精液品質(zhì)檢查后，向精液中添加的適合精于體外存活并保持受精能力的液體。精液稀釋的目的是：

1．?dāng)U大精液量，增加一次采精量的可配母畜數(shù)。

2．通過向精液中添加營養(yǎng)物質(zhì)和保護(hù)劑，可延長精子在體外的存活時(shí)間。

3．便于精液保存和運(yùn)輸。

（一）稀釋劑：稀釋劑主要用以擴(kuò)大精液容量，要求所選用的藥液必須與精液具有相同的滲透壓。嚴(yán)格地講，凡向精液中添加的稀釋液都具有擴(kuò)大精液容量的作用，均屬稀釋劑的范疇，但各種物質(zhì)添加各有其主要作用，一般用來單純擴(kuò)大精液量的物質(zhì)有等滲的氯化鈉、葡萄糖、蔗糖溶液等。

（二）營養(yǎng)劑：主要為精子體外代謝提供養(yǎng)分，補(bǔ)充精子消耗的能量。如糖類、奶類、卵黃等。

二、稀釋液的成分及作用

（三）保護(hù)劑

1、緩沖物質(zhì)：精子在體外不斷進(jìn)行代謝，隨著代謝產(chǎn)物(乳酸和CO2等)的累積，精液的pH逐漸下降，甚至?xí)l(fā)生酸中毒，使精子不可逆地失去活力。因此，有必要向精液中添加一定量的緩沖物質(zhì)，以平衡酸堿度。常用的緩沖劑有檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鉀等。近些年，生產(chǎn)單位采用三羥甲基氨基甲烷(Tris)作為緩沖劑，效果較理想。2、降低電解質(zhì)濃度物質(zhì)：副性腺中Ca2+、Mg2+等強(qiáng)電解質(zhì)含量較高，刺激精子代謝和運(yùn)動(dòng)加快，在自然繁殖中無疑有助于受精，但這些強(qiáng)屯解質(zhì)又能促進(jìn)精于早衰、精液保存時(shí)間縮短。為此，需向精液中加入非電解質(zhì)或弱電解質(zhì)，以降低精液電解質(zhì)的濃度。常用的非電解質(zhì)和弱電解質(zhì)有各種糖類、氨基乙酸等。3、抗冷物質(zhì)在精液保存過程中，常進(jìn)行降溫處理，如溫度發(fā)生急劇變化，會(huì)使精子遭受冷休克而失去活力。發(fā)生冷休克的原因使精子內(nèi)部的縮醛磷脂在低溫下凍結(jié)凝固，影響精子正常代謝，出現(xiàn)不可逆的變性死亡。因此，在保存的稀釋液中加入抗冷物質(zhì)，使精子免受傷害。常用的抗冷休克物質(zhì)有卵黃、奶類等。4．抗凍物質(zhì)在精液冷凍保存過程中，精液由液態(tài)向固態(tài)轉(zhuǎn)化，對(duì)精子的危害較大，不使用抗凍劑，冷凍精液就不能成功。一般常用甘油和二甲基亞礬(DMSO)作為抗凍劑。5．抗菌物質(zhì)在采精和精液處理過程中，雖嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，也難免使精液受到細(xì)菌的污染，況且稀釋液中含營養(yǎng)物質(zhì)較豐富，給細(xì)菌繁殖提供了較好條件。細(xì)菌過度繁殖不但影響精液品質(zhì)，輸精后也會(huì)使母畜生殖道感染，造成不孕。常用的抗菌物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、氨基苯磺胺等。（四）其它添加劑

除上述三種成分以外，另向精液中添加的、起某種特殊作用的微量成分都屬其他添加劑的范疇。1、激素類向精液中添加催產(chǎn)素、前列腺E型等，能促進(jìn)母畜子宮和輸卵管的蠕動(dòng)，有利于精子運(yùn)行，提高受胎率。

2、維生素類某些維生素如B1、B2、B12、C、E等具有改進(jìn)精子活力，提高受胎率的作用。

3、酶類過氧化氫酶能分解精液中的過氧化氫，提高精子活力；β—淀粉酶能促進(jìn)精子獲能等。

另外，向精液中添加有機(jī)酸、無機(jī)酸類進(jìn)行常溫保存；加入抗氧化劑、提高精子括力的精氨酸、咖啡因；區(qū)分精液種類的染料等都屬此類。

三、稀釋液的配制

1、稀釋液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，如配制后確需保存，經(jīng)消毒、密封后放入冰箱中最多能保存2—3d。

2、配制稀釋液的器具，用前必須洗凈并嚴(yán)格消毒，用稀釋液沖洗后才能使用。

3、配制稀釋液的蒸餾水要新鮮，最好現(xiàn)用現(xiàn)制。

4、所用藥品要純凈，一般使用分析純制劑。藥品稱量要準(zhǔn)確，經(jīng)溶解、過濾、消毒后方能使用。

5、卵黃要取自新鮮雞蛋，待稀釋液消毒冷卻后加入。

6、奶粉的顆粒比較大，溶解時(shí)先用等量蒸餾水調(diào)成漿糊狀，然后加蒸餾水至需要量，用脫脂棉過濾后放人90—95'C的水浴中消毒lOmin。

四、精液稀釋方法

1、精液稀釋應(yīng)在采精后立即進(jìn)行。2、采精后把精液迅速置于30℃的保溫瓶中，以防溫度的變化。3、稀釋時(shí)把精液和稀釋液同時(shí)放在300C的環(huán)境中，將稀釋液和精液的沮度調(diào)整一致，井在30℃的水浴中進(jìn)行稀釋。4、稀釋時(shí)把稀釋液沿著精液容器的壁慢慢加入精液中，邊加入邊攪拌。5、如需高倍稀釋，應(yīng)先做3—5倍的低倍稀釋，然后再高倍，以防稀釋打擊。五、精液的稀釋倍戴

1、精液稀釋倍數(shù)的確定，應(yīng)依據(jù)母畜每次受精所需的有效精子數(shù)、稀釋液的種類等。2、公牛的精液一般進(jìn)行10—40倍稀釋，公豬的精液一般做2－4倍稀釋?，F(xiàn)以公牛精液稀釋倍數(shù)的計(jì)算方法舉例如下：3、案例：有一頭黑白花種公牛一次采得鮮精11ml，經(jīng)檢查，精子活力為O．7，密度是12億／ml。如為母牛輸精時(shí)要求有效精于數(shù)不少于3000萬，輸精量為0.25ml，本次采得的精液處理后，能為多少頭母牛輸精？解：lml原精液中的有效精子數(shù)＝12億／ml×0.7＝8.4億／ml。

lml稀釋后的精液中的有效精子數(shù)＝0.3億÷0.25ml＝1.2億／ml

稀釋倍數(shù)＝8.4億／ml÷1.2億／ml＝7(倍)。輸精母牛頭數(shù)＝11ml×7

(倍)÷0.25ml＝308(頭)答：本次采得的精液能為300余頭母牛輸精?！緩?fù)習(xí)思考題】

1、精液稀釋的目的2、稀釋液的成分與作用3、稀釋液的配制應(yīng)注意的問題4、精液稀釋的方法5、精液的稀釋倍數(shù)與計(jì)算課題4精液保存、運(yùn)輸【目的要求】1、明確精液低溫保存的原理，掌握精液低溫保存的方法。

2、明確精液常溫保存的原理，掌握常溫保存的處理手段。

3、明確精液冷凍保存的原理，掌握冷凍精液的制作方法。【內(nèi)容重點(diǎn)】1、精液低溫保存、常溫保存和冷凍保存的原理。

2、精液低溫保存、常溫保存和冷凍保存的方法

3、冷凍精液的制作方法。

4、玻璃化學(xué)說、甘油、卵黃抗凍學(xué)說，為本課題難點(diǎn)?！緝?nèi)容講授】

精液稀釋后即可進(jìn)行保存。通過保存，可延長精子在體外的存活時(shí)間，便于使用和運(yùn)輸?，F(xiàn)行的精液保存方式有3種，即1、常溫(15—25℃)保存2、低溫(0－5℃)保存3、冷凍(—79—196℃)保存。常溫和低溫保存是液態(tài)，故稱液態(tài)保存。一、精液的常溫保存(一)常溫保存的溫度在15－250C之間，溫度允許有一定變動(dòng)，所以又稱為變溫保存或室溫保存。常溫保存所需設(shè)備簡單，特別適合豬的精液。(二)原理常溫保存是通過增加酸度，降低精液的pH來抑制精子的代謝活動(dòng)，以減少其能量消耗。酸性在一定范圍內(nèi)是可逆抑制，通常把pH調(diào)整到6.35左右。（三）方法1、向稀釋液中充入二氧化碳，如伊利尼變溫稀釋(1VT)。2、利用精子本身在代謝中產(chǎn)酸，自行調(diào)節(jié)pH，如康奈爾大學(xué)稀釋液(CUE)。3、向稀釋液中加入有機(jī)酸，如己酸稀釋液(CME)。

4、常溫保存的稀釋液除降低pH使精于代謝減慢外，還依靠給精子補(bǔ)充足夠的養(yǎng)分，同時(shí)加入抗菌物質(zhì)以抑制細(xì)菌的孳生。5、有的還在稀釋液中加入緩沖物質(zhì)；有的加入明膠以阻止精子運(yùn)動(dòng)。二、精液低溫保存(一)原理在體溫狀態(tài)下，精子的代謝正常，當(dāng)溫度降低時(shí)，精子的代謝活動(dòng)減慢，當(dāng)溫度降至0—5℃，精于的代謝較弱，幾乎處于休眠狀態(tài)。此時(shí)精子的物質(zhì)代謝和能量代謝均降到較低水平，廢物累積減少，且此溫下不利微生物的繁殖，故可達(dá)到保存目的。(二)方法精液進(jìn)行低溫保存時(shí)，應(yīng)采取逐步降溫的方法，并使用含卵黃的稀釋液，以防冷休克。

1、首先把稀釋后的精液，按著一個(gè)輸精量(羊10—20個(gè)輸精量)，分裝到一個(gè)容器中，封口，再包以數(shù)層棉花或紗布，最外層用塑料袋扎緊，防止水分滲入。2、把包裝好的精液放到0－5℃的低溫環(huán)境中，經(jīng)1—2h，精液即降至0—5℃。

（三）注意事項(xiàng)：1、在保存過程中，要維持溫度的恒定，防止升溫。2、如特殊情況或運(yùn)輸可用廣口保溫瓶進(jìn)行，在保溫瓶中加7—8成滿的冰塊，把包裝好的精液放在冰塊上蓋好，注意定期添加冰塊。

3、如無冰源，可采用化學(xué)制冷法，在冷水中加入一定量的氯化銨或尿素，可使水溫達(dá)2－4℃。三、精液冷凍保存精液冷凍保存是利用液氮(－196℃)或干冰(－79℃)作冷源；將精液處理后冷凍起來，達(dá)到長期保存的目的。精液冷凍保存是人工授精工作的一大進(jìn)步，由于保存時(shí)間的延長，使精液的使用不受地區(qū)的限制，從而加快了家畜品種的育成和改良速度。(一)精液冷凍保存的原理精子在超低溫下，其代謝幾乎停止，以生命相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)保存下來，當(dāng)溫度回升后，又能復(fù)蘇且具有受精能力。其理論依據(jù)是玻璃化假說和甘油保護(hù)學(xué)說。

1、玻璃化假說：認(rèn)為，物質(zhì)的存在形式有氣態(tài)、液態(tài)和固態(tài)，其中固態(tài)又分為結(jié)晶態(tài)和玻璃態(tài)。在不同的溫度條件下，這兩種形式可以相互轉(zhuǎn)化。

（1）結(jié)晶態(tài)：當(dāng)精液的溫度由冰點(diǎn)（0℃）逐漸降到－60℃左右時(shí)，精液中的水分由液態(tài)變成固態(tài)，其結(jié)構(gòu)按幾何圖式進(jìn)行有序排列，冰晶顆粒大而均勻，叫做結(jié)晶態(tài)或冰晶化。精液在形成結(jié)晶態(tài)時(shí)，由于緩慢降溫，精清中的水逐漸形成冰茬兒，精子被排斥到?jīng)]有凍結(jié)的那部分精液中，形成高滲液，造成精子內(nèi)外滲透壓差距增大，使精子失水干固而死亡；同時(shí)由于冰晶在擴(kuò)展移動(dòng)中，對(duì)精子長生機(jī)械壓力，破壞精子原生質(zhì)表層和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，也可引起精子死亡。因此，緩慢降溫形成冰晶化是造成精子死亡的主要原因。（2）玻璃態(tài)：是指當(dāng)精液由低溫驟然降到－60℃度以下，精液變成固態(tài)時(shí)，其結(jié)構(gòu)圖式進(jìn)行無序排列，冰晶顆粒細(xì)小而均勻，叫做玻璃態(tài)（化）。精液在形成玻璃化時(shí)，由于快速降溫，精清中的水分，在精子周圍迅速形成一層玻璃化膜，將精子保護(hù)起來，同時(shí)使精子迅速進(jìn)入休眠狀態(tài)；當(dāng)解凍快速升溫時(shí)，則玻璃態(tài)又可跨越結(jié)晶態(tài)直接變?yōu)橐簯B(tài)，使精子復(fù)蘇而恢復(fù)受精能力。經(jīng)試驗(yàn)證明，在0至－60℃是冰晶形成的溫度區(qū)域，而且在逐漸降溫的條件下才能形成。降溫越慢，冰晶形成越大，尤以－15至－25℃為甚。玻璃化必須在－60至－25℃的低溫區(qū)域內(nèi)，經(jīng)快速降溫，迅速越過冰晶化而形成。2、甘油保護(hù)學(xué)說：

快速降溫可使精液跨越結(jié)晶態(tài)進(jìn)入玻璃態(tài)，但急劇降溫會(huì)造成精子冷休克。研究表明，向稀釋液中添加甘油，不但可增強(qiáng)精子的抗凍能力，而且又可防止冰晶化和精子冷休克。

甘油又名丙三醇，分子式CH2（OH）－CH2（OH）－CH2（OH），為高熱能脂肪家族，其3個(gè)羥基（OH）為親水基團(tuán)，可與精液中的水結(jié)合，限制和干擾水分子的晶格排列，而產(chǎn)生冰晶；其烴鏈為疏水基團(tuán)，朝向精子，可阻止精子的內(nèi)外水分相互滲透，從而使精子保護(hù)在玻璃化膜中。

但是，甘油濃度高時(shí)，對(duì)精子有危害作用，應(yīng)掌握甘油的用量。一般牛冷凍精液中甘油通常加入5％-7％。

除甘油外，其他多羥化合物如二甲基亞砜(DMSO)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、卵黃、糖類等都具有抗凍作用。(二)精液冷凍技術(shù)

牛的精液冷凍已普及，現(xiàn)以牛精液冷凍為例，將精液冷凍制作技術(shù)敘述如下：1、采精及精液品質(zhì)摟查：精液冷凍效果與精液品質(zhì)密切相關(guān)。做好采精的準(zhǔn)備和操作，爭取獲得優(yōu)質(zhì)的精液。2、精液稀釋：根據(jù)凍精的種類、分裝劑型和稀釋倍數(shù)的不同，精液的稀釋方法也不盡一致，現(xiàn)生產(chǎn)中多采用一次或兩次稀釋法：

一次稀釋法：將含有甘油、卵黃等的稀釋液按一定比例加入精液中，適合于低倍稀釋。

兩次稀釋法：為避免甘油與精子接觸時(shí)間過長而造成的危害，采用兩次稀釋法較為合理。首先用不含甘油的稀釋液(第一液)對(duì)精于進(jìn)行最后稀釋倍數(shù)的半倍稀釋，然后把該精液連同第二液一起降溫至0-50C(全程1h左右)，并在此溫下作第二次稀釋。3、降溫平衡

采用一次稀釋法，由于稀釋溫度為30℃，需經(jīng)1—2h緩慢降溫至0－5℃，以防冷休克的發(fā)生。平衡是降溫后，把稀釋后的精液放置在0-5℃的環(huán)境中停留2-4h，使甘油充分滲入精于內(nèi)部，起到膜內(nèi)保護(hù)劑作用的過程。

4、精液的分裝

現(xiàn)行凍精常采用顆粒、細(xì)管和袋裝等分裝方法。

(1)顆粒凍精將精液滴凍在經(jīng)液氮致冷的金屬網(wǎng)或塑料板上，冷凍后制成0．1m1左右的顆粒。顆粒凍精曾在牛中廣泛應(yīng)用，現(xiàn)多用于馬、綿羊及野生動(dòng)物的凍精劑型，具有成本低、制作方便等優(yōu)點(diǎn)，但不易標(biāo)記，解凍麻煩，易受污染。

(2)細(xì)管凍精把平衡后的精液分裝到塑料細(xì)管中，細(xì)管的一端塞有細(xì)線或棉花，其間放置少量聚乙烯醇粉(吸水后形成活塞)，另一端封口，冷凍后保存。細(xì)管的長度約13cm，容量有0.25、0.5或1.Oml?，F(xiàn)生產(chǎn)中牛的凍精多用0.25m1劑型。細(xì)管凍精具有不受污染、容易標(biāo)記、易貯存、適于機(jī)械化生產(chǎn)等特點(diǎn)，是最理想的劑型。

(3)袋裝凍精馬和豬輸精量大，可用塑料袋分裝，但目前冷凍效果不理想。5、凍結(jié)

(1)干冰埋植法適合于小規(guī)模生產(chǎn)及液氮缺乏地區(qū)。

顆粒凍精：把干冰置于木盒中，鋪平壓實(shí)，用預(yù)先做好的模板在干冰上壓出直徑0.5cm、深2—3cm的小孔，用滴管將平衡后的精液0.1ml左右滴人孔內(nèi)，覆以干冰，2—4min后，收集凍精保存。

細(xì)管凍精：將分裝的凍精平鋪于壓實(shí)的干冰上，并迅速用于冰覆蓋，2-4min取出貯存于干冰或液氮中。

(2)液氮法

顆粒凍精：在廣口液氮桶上安裝銅紗網(wǎng)，調(diào)至距液氮面1—3cm，預(yù)冷幾分鐘后，使紗網(wǎng)附近溫度達(dá)-80—-1000C，將精液均勻地滴壓在銅紗網(wǎng)上，2-4min后，待精液顆粒充分凍結(jié)、顏色變淺發(fā)亮?xí)r，用小鏟輕輕鏟下顆粒凍精，每50-100粒裝入紗布袋中，沉入液氮保存。

細(xì)管凍精：除按上述方法對(duì)細(xì)管進(jìn)行熏蒸冷凍外，也可采用液氮浸泡法。把分裝好的精液細(xì)管平鋪于特制的細(xì)管架上，放人盛裝液氮液氮柜中浸泡，蓋好，5min后取出保存。這種方法啟動(dòng)溫度低，冷凍效果好。（三）凍精的貯存

目前，凍精保存普遍采用液氮做冷源，以液氮罐為容器貯存和分發(fā)凍精。

1、液氮及其特性

液氮是空氣中的氮?dú)饨?jīng)分離、壓縮形成的一種無色、無味、無毒的液體，沸點(diǎn)溫度為—195．8℃。在常溫下，液氮沸騰，吸收空氣中的水氣形成白色煙霧。液氮具有很強(qiáng)的揮發(fā)性，當(dāng)溫度升至180C時(shí)，其體積可膨脹680倍。此外，液氮又是不活潑的液體，滲透性差，無殺菌能力。

基于液氮的上述特性，使用時(shí)要注意防止凍傷、噴濺、窒息等，用氮量大時(shí)要保持空氣通暢，注意保護(hù)。2、液氮容器

包括液氮貯運(yùn)容器和凍精貯存容器，前者為貯藏和運(yùn)輸液氮用，后者為專門保存凍精用(圖5—9)。當(dāng)前冷凍精液專門使用的液氮罐型號(hào)較多，但其結(jié)構(gòu)基本相同。

(1)罐壁由內(nèi)外兩層構(gòu)成，一般由堅(jiān)硬的合金制成。(2)夾層指內(nèi)外殼之間的空隙。為增加罐的保溫性，抽成真空。真空度為1．33X10-4pa，在夾層中裝有活性碳、硅膠及鍍鋁絳綸薄膜等，以吸收漏入夾層的空氣，也增加了罐的絕熱性。(3)罐頸由高熱阻材料制成，是連接罐體和罐壁的部分，較為堅(jiān)固。(4)罐塞由絕熱性好的塑料制成，具有固定提筒手柄和防止掖氮過廈揮發(fā)的功能。(5)提筒是存放凍精的裝置。提筒的手柄由絕熱性良好的塑料制成，既能防止溫度向液氮傳導(dǎo)，又能避免取凍精時(shí)凍傷。提筒的底部有多個(gè)小孔，以便液氮滲入其中。液氮罐的構(gòu)造3、液氮容器使用應(yīng)注意的問題

液氮容器主要是靠真空和減少導(dǎo)熱來維持其冷藏性能。使用時(shí)應(yīng)注意：（1）用前仔細(xì)檢查外觀，看是否又碰傷；然后倒入液氮檢查其損耗情況。（2）存放于陰涼、干燥、通風(fēng)良好的室內(nèi)，嚴(yán)禁靠近熱源和室外日曬雨淋。（3）使用過程中盡量避免碰撞、振動(dòng)，嚴(yán)禁橫放、疊放或倒置。（4）存放液氮的容器要用瓶塞蓋好，但瓶口不能密閉，以防爆炸。（5）存放精液等要定期補(bǔ)充液氮，確保凍精浸入液氮中。（6）取放凍精時(shí)，要盡量避免碰撞頸口。

（7）液氮罐要定期清洗，以免污染凍精?！緩?fù)習(xí)思考題】

1、精液保存的意義

2、精液保存的方法及保存溫度3、精液冷凍保存的原理，4、簡述玻璃化假說和甘油保護(hù)學(xué)說5、牛精液冷凍的程序6、液氮的特性及使用注意事項(xiàng)7、液氮罐使用注意事項(xiàng)課題5輸精【目的要求】

1、熟練輸精前的準(zhǔn)備

2、準(zhǔn)確判定各種家畜的輸精時(shí)間

3、掌握各種家畜的輸精方法?！净緝?nèi)容】1、輸精前的準(zhǔn)備

2、輸精的基本要求

3、輸精方法

【內(nèi)容重點(diǎn)】

1、輸精前的準(zhǔn)備2、輸精的基本要求3、牛的冷凍精液輸精。【內(nèi)容講授】

一、輸精的準(zhǔn)備輸精是人工授精的最后一個(gè)環(huán)節(jié)，也是最重要的技術(shù)之一，能否及時(shí)、準(zhǔn)確地把精液輸送到母畜生殖道的適當(dāng)部位，是保證受胎的關(guān)鍵。輸精前應(yīng)做好各方面的準(zhǔn)備，確保輸精的正常實(shí)施。

(一)器械的準(zhǔn)備輸精器械主要為輸精器，用前應(yīng)徹底洗凈、嚴(yán)格消毒，再用稀釋液沖洗才能使用。每頭家畜備一支輸精管，如用同一支給另一頭母畜輸精，需消毒處理后方能使用。

(二)母畜的準(zhǔn)備

母畜經(jīng)發(fā)情鑒定后，確定已到輸精時(shí)間，將其牽入保定欄內(nèi)保定，外陰清洗消毒，尾巴拉向一側(cè)。

(三)精液準(zhǔn)備

1、常溫保存的精液:需輕輕振蕩后升溫至35℃，鏡檢精子活力不低于0.6。2、低溫保存的精液:升溫后活力在0．5以上。3、冷凍精液:解凍后活力不低于0.3。解凍方法是（1）細(xì)管凍精：在解凍時(shí)可直接投放在40－450C溫水中，待凍精一半融化即可取出備用。(2)顆粒凍精:解凍時(shí)需預(yù)先準(zhǔn)備解凍液。牛的解凍液常用2．9％的檸檬酸鈉溶液。解凍時(shí)取一小試管，加入1ml解凍液，放在盛有溫水的燒杯中，當(dāng)與水溫相同時(shí)，取一粒凍精于小試管內(nèi)，輕輕搖晃使凍精融化。(四)人員準(zhǔn)備

輸精人員應(yīng)穿好工作服，指甲剪短磨光手臂挽起并用75％酒精消毒，伸人陰道的手要涂以稀釋液等潤滑。

二、輸精的基本要求

(一)輸精時(shí)間：輸精時(shí)間是根據(jù)母畜的排卵時(shí)間、精子在母畜生殖道內(nèi)保持受精能力的時(shí)間及精于獲能等時(shí)間確定的。

1．牛的輸精時(shí)間母牛發(fā)情持續(xù)期短，發(fā)現(xiàn)母牛發(fā)情后8一lOh即可進(jìn)行第一次輸精，隔8～12h進(jìn)行第二次輸精。牛早上發(fā)情，當(dāng)日下午或傍晚第一次輸精，次日早第二次輸精；下午或晚上發(fā)情，次日早進(jìn)行輸精；次日下午或傍晚再輸一次。初配母牛發(fā)情持續(xù)期稍長，輸精過早受胎率不高，通常在發(fā)情后20h左右開始輸精。在第二次輸精前，最好檢查一下卵泡，如母牛已排卵，一般不必再輸精。

2．豬的輸精時(shí)間母豬發(fā)情外部表現(xiàn)特別明顯，外陰長時(shí)間紅腫，通過外部觀察難以確定輸精時(shí)間。一般母豬發(fā)情后的20—30h內(nèi)輸精2次，或發(fā)情盛期過后仍出現(xiàn)“壓背反射”時(shí)輸精。

3．羊的輸精時(shí)間母羊的輸精時(shí)間應(yīng)根據(jù)試情制度確定。每天一次試情，在發(fā)情的當(dāng)天及半天后各輸精一次；每天2次試情，發(fā)現(xiàn)母羊發(fā)情后隔半日進(jìn)行第一次輸精，再隔半日進(jìn)行第二次輸精。

4．馬(驢)的輸精時(shí)間

(1)

根據(jù)母馬(驢)的卵泡發(fā)育情況來判定。母馬(驢)的卵泡發(fā)育可分為六個(gè)時(shí)期，一般按著“三期酌配、四期必輸、排后靈活追補(bǔ)”的原則安排輸精時(shí)間。排卵后如