基因工程干擾素

基因工程操作流程利用ncbi查找目的基因序列利用oligo設(shè)計引物利用PCR技術(shù)擴增目的基因選擇載體，抽提質(zhì)粒制備感受態(tài)細胞目的基因與載體重組外源基因?qū)胧荏w細胞重組子篩選外源基因的表達利用NCBI查找目的基因打開NCBI網(wǎng)站，我們查找了人類ɑ-干擾素的基因。查找之后利用oligo軟件設(shè)計引物查找引物查找酶切位點，點擊search編輯上下游引物得到上游引物為：5‘-GTCGGTACCGACGACGACAAGTGCGATCTGCCGCAGACCCATA-3’下游引物為：5'-TAAGAATTCTTATTATTCTTTGCTTTTCAGGCGT-3’上游引物的酶切位點是Kpn1(GGATCC)下游引物的酶切位點是EcoR1(GGTACC)利用PCR技術(shù)體外擴增目的基因以上兩條引物與表達載體的部分序列重疊，并覆蓋Kpn1和EcoRI兩個酶切位點．用以上經(jīng)純化的連接產(chǎn)物作為模板，用上下游引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系如下：模板2ul上游引物V-100uM)1ul下游引物F-200uM1ul10XTaqDNA聚合酶緩沖液5uldNTP混合物f各2．5mM)4ulMgCl2(25mlV03ulTaq酶1uldH2033ul總量50ulPCR反應(yīng)條件如下：94℃3min94℃20s58℃25s

20循環(huán)72℃25s72℃5min一般是94度變性5min，之后“94度變性、退火（不同引物溫度不同）、72度”延伸共30-35個循環(huán)，再72度延伸10min，最后hold16度即可。反應(yīng)體系一般有20微升或50微升，由上下游引物、buffer、dNTP、模板、Taq酶和水等組成，配好后放入PCR儀中按設(shè)定程序進行即可。選擇載體和抽提質(zhì)粒1、質(zhì)粒DNA的分離純化一般含有單個目的基因的DNA片段，即使進入了宿主細胞也不能進行增殖。通常它需要同適當?shù)哪茏晕覐?fù)制的DNA分子（例如質(zhì)粒、噬菌體DNA等）結(jié)合后，才能在通過轉(zhuǎn)化或其他途徑導(dǎo)入宿主細胞，像正常質(zhì)粒或病毒一樣增殖和易于檢測。分離質(zhì)粒載體DNA有許多方法，但其共同步驟是先用溶菌酶處理含有質(zhì)粒載體的宿主菌培養(yǎng)物，以除去其細胞壁，然后加入去污劑（例如SDS），使其發(fā)生溫和的溶菌作用。這樣質(zhì)粒DNA、多聚核糖體、可溶性蛋白質(zhì)、tRNA等細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)便逐步地釋放出來，而核染色體的DNA則仍然附著在細胞的殘渣碎片上，經(jīng)過離心處理，可使其同質(zhì)粒分開。將離心所得的含有質(zhì)粒DNA的上清液，加酚處理除去蛋白。剩下的DNA混合物中，質(zhì)粒DNA（cccDNA）呈超螺旋狀態(tài)。為進一步純化出cccDNA分子，可在含有溴化乙錠（EB）染料和氯化銫溶液中進行密度梯度離心。EB是一種扁平分子，它能插入雙鏈DNA分子的兩個相鄰堿基對之間，從而降低了DNA分子在氯化銫中的密度。又由于cccDNA同EB的結(jié)合能力比開環(huán)DNA和線性DNA低得多，這樣在氯化絕密度梯度中便可容易地將cccDNA同其他兩種類型的DNA分離開來其他載體DNA分高純化的原理與上述類似。2、目的基因與載體的連接。

外源DNA片段與載體DNA分子的連接，即DNA分子的體外重組，主要依賴于限制性內(nèi)切核酸酶及DNA連接酶的作用。在進行連接時，一般需要注意以下幾點：①實驗步驟盡可能簡單容易；②在連接后，接點序列能被一定的限制酶重新酶切，以便回收插入片段；③對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不發(fā)生干擾。我們選擇載體pET32a(+）Map感受態(tài)細胞的制備首先配制以下試劑：1)SOB培養(yǎng)基配制500mlSOB培養(yǎng)基，在450ml水中加入以下試劑：胰蛋白胨(tryptone)10g酵母提取物(yeastextract)．2．5gNaCl0．25g用電磁攪拌器攪拌使其完全溶解，然后加入250mmol／LKCI溶液5ml，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至7．0．然后加dH20定容至500ml，高壓滅菌．在使用前加入2．5ml經(jīng)滅菌的2mol/LMgCl2溶液。配置200mlTBbuffer，加入以下溶液：KCl40mlMnCl2

24mlCaCl2

6mlK-MESbuffer

5mldH20

125ml總量

200ml1)大腸桿菌(LB培養(yǎng)基含7％DMSO保種)解凍，接種于LB平皿上，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜．2)挑取單克隆，轉(zhuǎn)入500mlSOB培養(yǎng)基中，1813，搖床培養(yǎng)18～24h左右，直到OD600值達到0．6為止．3)從搖床上取出搖瓶，將菌體轉(zhuǎn)到500mi離心管，冰浴10min．4)3500rpm，4℃，冷凍離心，10min，棄上清．5)用150ml冰浴過的TBbuffer重懸菌體沉淀，再次冰浴10min，按步驟4條件離心，棄上清．6)用40mlTBbuffer和2．8mlDMSO的混合液(DMS0的含量約占7％)再次重懸沉淀．7)冰浴10min，混勻，超凈臺內(nèi)分裝(每管0．5～1．0m1)感受態(tài)大腸桿菌，置液氮罐中冷凍保存．用時從液氮罐中取出放在冰上約20min，融化后即可用于轉(zhuǎn)化．按照酶切試劑盒的說明先用Kon1分別對pET32a(+)載體和目的基因進行酶切。37℃，酶切4h，用PCR純化試劑盒純化，35.0uldH2O洗脫，然后再用EcoRI酶切.最后用1．5％的瓊脂耱回收酶切后的pET32a(+)載體和目的基因質(zhì)粒的酶切片斷，然后用T4DNA連接酶，16℃連接回收片斷，轉(zhuǎn)化至克隆菌。為了使連接反應(yīng)物中盡可能多的外源DNA片段插入載體分子，以形成重組DNA，必須阻止在限制酶切割后線性載體分子的自身環(huán)化作用。具體可采用以下方法：（1）用堿性磷酸酶處理限制酶酶解產(chǎn)生的線性載體分子.（2）采用同聚物加尾連接技術(shù)，