基于分級補料法的玉米秸稈酶解糖化工藝優(yōu)化

基于分級補料法的玉米秸稈酶解糖化工藝優(yōu)化

通過熱化學(xué)和生物化學(xué)等途徑，現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)通過多種先進的轉(zhuǎn)化技術(shù)，生產(chǎn)固、液、氣等尖端能源，并利用能源裝置為人類生產(chǎn)和生活提供能源。木質(zhì)纖維素的高效水解是實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化為生物燃料和生物制品關(guān)鍵技術(shù)之一,如生物乙醇、生物丁醇、生物制氫等都是建立在木質(zhì)纖維素高濃度水解糖平臺基礎(chǔ)之上。因此,開展高效的木質(zhì)纖維素糖化技術(shù)研究是實現(xiàn)高值化利用的重要途徑。在纖維乙醇研究領(lǐng)域中,纖維素原料高濃度還原糖水解液的獲得有利于提高后期乙醇高濃度發(fā)酵并降低乙醇蒸餾的能耗和經(jīng)濟成本。由于木質(zhì)纖維素原料質(zhì)地疏松、能量密度小、浸水性差等特點,致使一次性加料固形物濃度較低,水解還原糖濃度處于較低水平。Rudolf等認為分批補料法可以提高水解液糖濃度,是一種解決乙醇發(fā)酵濃度較低有效的途徑之一。目前,基于木質(zhì)纖維素酶水解機理模型,圍繞木質(zhì)纖維素高濃度水解液的技術(shù)體系優(yōu)化,降低或消除水解過程中產(chǎn)物反饋抑制效應(yīng)已經(jīng)成為研究的重點之一。Pristavka等研究了在非連續(xù)攪拌反應(yīng)器中,21%的秸稈固形物,纖維素添加量42FPU/g秸稈,還原總糖濃度達到160g/L。趙晶等采用分批補料酶解工藝,使底物最終質(zhì)量濃度達到200g/L,纖維素酶20FPU/g(底物)和纖維二糖酶6.5CBU/g(底物)酶解60h后還原糖濃度達到116.3g/L,酶解得率達到80.1%。雖然纖維素高濃度水解技術(shù)并取得了一定進展,但仍然存在兩個較為突出的問題:一是纖維素酶用量大,酶的添加量通常為20~45FPU/g原料;二是還原糖濃度較低,通常在100g/L以下,且糖化時間較長,這些不利因素制約纖維乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進程。本研究針對纖維素高濃度水解過程中酶加載量較高和糖化周期較長等問題,以稀硫酸預(yù)處理的玉米秸稈為原料,采用分批補料糖化的方法,對影響纖維素高濃度水解液的條件進行優(yōu)化,有利于構(gòu)建木質(zhì)纖維素的高濃度水解技術(shù)體系。該補料糖化方法的建立,為以后纖維液體燃料工業(yè)化生產(chǎn)中補料控制提供了有益的啟示和參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1原材料玉米秸稈:取自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)北郊科教試驗園區(qū),粉碎100~200目,水分含量12%,經(jīng)測定原料及其預(yù)處理后的主要成分含量如表1所示。1.1.2木聚糖酶cmc纖維素酶:購自無錫杰能科生物工程有限公司,濾紙酶活180FPU/mL。木聚糖酶:購自無錫杰能科生物工程有限公司,CMC酶活4.5×104U/mL。果膠酶:購自寧夏和氏壁生物技術(shù)有限公司,酶活5.0×105U/g。1.2方法1.2.1醋酸酶解醋酸鈉緩沖液的制備每次準確稱取玉米秸稈原料10g放于300mL三角瓶中,平行3次,用1%稀硫酸溶液浸潤,初始固形物含量為20%(W/V),121℃處理60min后,冷卻至室溫,在pH4.8醋酸-醋酸鈉緩沖液進行酶解。原料酶添加量為:木聚糖酶220U/g,纖維素酶6FPU/g,果膠酶50U/g,溫度45℃,轉(zhuǎn)速為120r/min,每隔24h測定還原糖濃度。1.2.2冷卻、干燥補料原料:玉米秸稈原料經(jīng)1%稀硫酸,固形物含量為20%,121℃處理60min后,冷卻至室溫,抽濾,105℃烘干備用。補料糖化:從一次性加料糖化實驗中得到的最佳條件作為補料糖化過程的最初含量,每隔24h對原料進行補料,補料前測定還原糖濃度。補酶量:每克補加原料酶添加量為木聚糖酶20U/g,纖維素酶2FPU/g。1.3酶活、酶活、纖維素、纖維素的測定纖維素酶酶活測定:采用QB2583-2003測定。木聚糖酶酶活測定:采用GB23874-2009測定。果膠酶酶活測定:采用QB1502-92測定。纖維素、半纖維素、木素的測定:采用范氏(VanSoest)纖維測定法。總還原糖濃度測定:采用DNS法測定。2結(jié)果與分析2.1比對補料糖化的影響纖維素酶降解發(fā)生在固、液相界面較為復(fù)雜的過程,影響這個動態(tài)過程的因素有很多,一方面與纖維素自身的結(jié)晶區(qū)類型、聚合度、分子質(zhì)量有關(guān);另一方面與水解液的理化性質(zhì)及酶作用表面結(jié)構(gòu)的吸附與解析等密切相關(guān)。首先考察了液固比對補料糖化的影響,從圖1可以看出,當液固比為5,即固形物含量為20%(W/V)時,間隔24h進行分批補料,48h和72h時還原糖濃度分別為108.7g/L和117.6g/L,比對照相應(yīng)增加了20.8g/L和23.0g/L,表明隨著分批補料的添入,還原總糖的濃度顯著增加,但還原總糖增幅減少。從圖2可以看出,當液固比為6,48h和72h時還原糖濃度分別為89.8g/L和106.2g/L,比對照相應(yīng)增加了3.6g/L和13.2g/L。圖1和圖2結(jié)果表明通過分批補料的方法可以獲得較高濃度的還原總糖,表明分批補料可以提高促進水解液中游離態(tài)的酶吸附與底物的降解,從而提高糖化體系中酶的利用效率,降低酶的相對使用量。2.2l和84.7g/l在進行液固比對分批補料糖化影響的基礎(chǔ)上,研究了分批補料料量對糖化體系的影響。如圖3所示,一次補料糖化結(jié)束后,補料4%(W/V)、6%(W/V)和8%(W/V)還原糖與對照相比分別增加了15.5g/L、26.1g/L和44.7g/L;表明隨著一次分批補料量的增加,還原總糖的增幅相對增加;二次補料糖化結(jié)束時,補料4%(W/V)、6%(W/V)和8%(W/V)還原糖與對照相比分別增加了34.6g/L、46.7g/L和58.0g/L,但在這一補料糖化階段,補料6%(W/V)與8%(W/V)相比,增量分別為21.5g/L和13.6g/L,表明隨著二次分批補料量的增加,還原總糖的增幅相對減少,這與水解液體系中增加木質(zhì)素含量濃度相對增加有關(guān),以致影響固、液相界面游離態(tài)酶的可及性,這與Zhao等和Mosier等對纖維質(zhì)高濃度糖化水解的研究結(jié)果相一致,隨著酶解糖化的持續(xù)進行,不易降解的底物如木質(zhì)素,部分結(jié)晶度較高的(半)纖維素可能阻礙酶的吸附和解吸效率。2.3補料量對還原糖含量的影響基于分批補料量不同對糖化的影響,研究同時分別補料與酶的研究,通過少量的酶,以增強底物對酶的吸附與解吸附問題,從而有利于提高底物的轉(zhuǎn)化率,獲得高濃度的纖維素水解液。從圖4中可以看出,一次補料同時補酶時,產(chǎn)生的還原糖濃度比只補料產(chǎn)生的還原糖濃度分別提高13.5g/L、15.8g/L和16.6g/L。經(jīng)過二次補料補酶后,補料4%(W/V)、6%(W/V)和8%(W/V)時還原糖濃度分別為116.2g/L、122.5g/L和138.5g/L。結(jié)果分析表明隨著補料量的增加,產(chǎn)生的還原糖濃度也在增加,在經(jīng)過一次補料補酶后,不同的補料量產(chǎn)生的還原糖濃度基本相同,還原糖濃度都增加了約25~27g/L。從二次補料補酶的結(jié)果中可以看出,在48~72h水解過程中,補料8%(W/V)還原糖濃度達到138.5g/L。試驗結(jié)果表明,糖化過程中分批補料補酶工藝可以有效提高還原糖的濃度。3木聚糖酶催化反應(yīng)本研究以稀硫酸預(yù)處理后的玉米秸稈為原料,采用分批補料工藝方法,對影響纖維素高濃度水解液的條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明:固形物含量為20%(W/V)玉米秸稈經(jīng)1%稀硫酸溶液浸潤,121℃處理60min后,冷卻至室溫,在醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.8)中進行,原料酶添加量為木聚糖酶220U/g,纖維素酶6FPU/g,果膠酶50U/g,溫度45℃,轉(zhuǎn)速為120r/min開始進行糖化,糖化24h和48h后分別向水解液中加入8%的物料和補料量相應(yīng)的木聚糖酶20U/g(底物),纖維素酶2FPU/g(底物),糖化72h后水解液最終還原總糖達到138.5g/L,原料的酶解率最終達到理論值的62.5%。纖維素原料高濃度水解液的獲得是實現(xiàn)其高濃度發(fā)酵并降低纖維乙醇生產(chǎn)成本的必要條件。本實驗室以前對一次添加秸稈原料的酶解條件進行了研究,結(jié)果表明原料可以達到較高的酶解效率,但水解液中還原糖濃度僅為48.5g/L,水解糖的濃度始終處于較低的水平。采用與本研究中相同的預(yù)處理條件和酶解條件,對稻草秸稈酶解72h后,水解液中還原糖濃度為84.22g/L。本文基于補料糖化策略,通過分批添加底物的方式獲得了較高還原糖濃度的纖維素水解液。與以前的非補料糖化72h實驗結(jié)果相比,表明補料法可以顯著提高還原總糖濃度。該結(jié)果與趙晶等研究結(jié)果相比,減少了纖維酶用量,還原糖濃度提高了19.1%,但原料的酶解率降低了17.6%。在木質(zhì)纖維素