丹莪婦康煎膏對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1表達(dá)的影響

丹莪婦康煎膏對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1表達(dá)的影響

子宮內(nèi)膜綜合征（iu）是婦女的常見(jiàn)病。近年來(lái)，發(fā)病率顯著增加，引起了學(xué)術(shù)界的關(guān)注，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。Sampson最早提出了子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō),月經(jīng)期脫落的子宮內(nèi)膜碎片,隨經(jīng)血逆流經(jīng)輸卵管進(jìn)入腹腔,種植于卵巢和鄰近的盆腔腹膜,并繼發(fā)生長(zhǎng)和蔓延,發(fā)展成EMS。在這一過(guò)程中,脫落的子宮內(nèi)膜碎片的遷移和侵襲能力至關(guān)重要。而異位內(nèi)膜的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)之間的平衡失調(diào),會(huì)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解,增加異位內(nèi)膜侵襲力?？梢?jiàn),MMPs/TIMPs系統(tǒng)在EMS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用。丹莪婦康煎膏(DFD)為臨床治療EMS的常用中藥,能活血化瘀,疏肝理氣,調(diào)經(jīng)止痛,軟堅(jiān)化積。我們前期研究發(fā)現(xiàn),其對(duì)EMS大鼠有較好治療作用,但作用機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)采用子宮內(nèi)膜自體移植法建立大鼠EMS模型,通過(guò)觀察丹莪婦康煎膏對(duì)EMS大鼠異位子宮內(nèi)膜組織MMP-9和TIMP-1mRNA表達(dá)的影響,探討其防治EMS作用的機(jī)制。1材料表面1.1syxk冀Wistar大鼠,清潔級(jí),雌性,180～200g[河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK(冀)2006-0047,動(dòng)物合格證號(hào)1009075]。飼養(yǎng)于溫度20～23℃,濕度45%～60%,過(guò)氧乙酸溶液消毒環(huán)境。1.2孕三烯酮和慶大霉素丹莪婦康煎膏(昆明滇虹藥業(yè)有限公司,批號(hào)100404);孕三烯酮(北京紫竹藥業(yè),批號(hào)53110101);慶大霉素(石家莊制藥集團(tuán)有限公司,批號(hào)068100905);苯甲酸雌二醇(上海通用藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)009004)。1.3timp-1擴(kuò)增片段的構(gòu)建RT-PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司];Trizol(美國(guó)Invitrogen公司);PCR引物序列:MMP-9上游引物:5′-AAAGGTCGCTCGGATGGTTA-3′,下游引物5′-AGGATTGTCATCTGGAGTCGA-3′,預(yù)擴(kuò)增片段為619bp;TIMP-1上游引物:5′-GCTAAATTCATGGGTTCCCCAG-3′,下游引物5′-TTGCTGAGCAGGGCTCAGATTA-3′,預(yù)擴(kuò)增片段為279bp;β-actin上游引物5′-TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG-3′,下游引物5′-GGAACCGCTCATTGCCGATAGT-3′,預(yù)擴(kuò)增片段為576bp。1.4pcr擴(kuò)增及衍射分析超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);756MC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);PE9600型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司);電泳儀及電泳槽(北京六一儀器廠(chǎng));BIO-PROFIF凝膠圖像分析系統(tǒng)(法國(guó)VL公司);紫外透射儀(北京鼎國(guó)昌盛生物制品有限公司);MDF-382E超低溫保存箱(日本SANYO公司);1-15K高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)。2方法2.1患者安氏肌肉注射給予大鼠精子組織及術(shù)后觀察采用自體移植法建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉2mL·kg-1,待麻醉后固定于操作板上。開(kāi)腹找到子宮,暴露左側(cè)子宮,在離卵巢約1cm處,分離附著于子宮肌壁的脂肪和結(jié)締組織,兩端分別用手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎,剪取中間約1cm長(zhǎng)子宮組織,縱向剖開(kāi)宮腔,暴露子宮內(nèi)膜,切取5mm×5mm的子宮壁塊。在腹壁切口右側(cè)的腹肌與皮下筋膜層之間打隧道,以正好能置入子宮壁塊為宜,將子宮壁塊平整的置入右側(cè)隧道底部,使內(nèi)膜面緊貼腹肌,常規(guī)關(guān)閉腹腔。假模型組按上述方法切取子宮組織,丟棄,關(guān)腹,其他操作同上。術(shù)后,每只大鼠腹腔注射慶大霉素0.4萬(wàn)單位,連續(xù)5d。術(shù)后次日,各鼠肌肉注射雌二醇0.1mg·kg-1,每隔4d1次,共3次,以促進(jìn)移植內(nèi)膜的生長(zhǎng)。術(shù)后每周觸摸包塊2次,觀察是否出現(xiàn)包塊及包塊的體積變化。術(shù)后第21天,將大鼠麻醉后固定,開(kāi)腹,觀察異位內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化。以游標(biāo)卡尺測(cè)量異位內(nèi)膜組織體積,若體積增大≥8mm3,并出現(xiàn)液體積聚,隆起呈透明小囊狀,則為造模成功。2.2單次給藥劑量ldf取造模成功的大鼠40只,隨機(jī)分為模型組(MG),丹莪婦康煎膏高劑量組(DFD-H,6g·kg-1·d-1)、低劑量組(DFD-L,3g·kg-1·d-1)、孕三烯酮組(GSG,1.25mg·kg-1·d-1),每組10只。另設(shè)假手術(shù)組(SHM)大鼠10只。各組大鼠每日灌胃給藥(或蒸餾水)1次,給藥容量為10mL·kg-1,連續(xù)30d。末次給藥后禁食12h,麻醉,開(kāi)腹,快速剪取異位子宮內(nèi)膜組織,假手術(shù)組剪取在位子宮內(nèi)膜組織,用高溫滅酶的鋁箔紙密封包裹,-80℃凍存。2.3mmp-1-actinTrizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR條件:MMP-9:94℃變性3min;94℃40s,55℃退火50s,72℃90s,循環(huán)30次;72℃延伸10min。TIMP-1:退火溫度為58℃,其他條件同MMP-9;β-actin:退火溫度為59℃,其他條件同MMP-9。反應(yīng)結(jié)束后,PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,以DNAMarker(DL2000)作為標(biāo)準(zhǔn)片段標(biāo)記,電泳后于紫外透射儀觀察,并用數(shù)碼相機(jī)照相,輸入微機(jī)應(yīng)用QuantityOne凝膠圖像分析軟件對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行分析,以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照,結(jié)果以?xún)烧咧e分吸光度的比值表示。2.4分析過(guò)程統(tǒng)計(jì)結(jié)果用(ˉx±s)表示,采用SPSS11.5進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)先行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),各組間比較采用單因素方差分析,樣本均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。3結(jié)果3.1各組大鼠精子內(nèi)皮中mmp-9mrna表達(dá)的比較模型大鼠異位子宮內(nèi)膜組織MMP-9mRNA的表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)量(P<0.01)。丹莪婦康煎膏各劑量組及孕三烯酮組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織MMP-9mRNA的表達(dá)量較模型組顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。3.2各組大鼠精子內(nèi)皮組織timp-1的表達(dá)量模型大鼠異位子宮內(nèi)膜組織TIMP-1mRNA的表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)量(P<0.01)。丹莪婦康煎膏各劑量組及孕三烯酮組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織TIMP-1mRNA的表達(dá)量較模型組顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。4儲(chǔ)底膜的活性EMS是一種危害婦女健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。正常情況下,子宮內(nèi)膜覆蓋于子宮體腔面,如因某些因素,使子宮內(nèi)膜在身體其他部位生長(zhǎng),即可成為EMS。EMS可致痛經(jīng)并進(jìn)行性加重,還可引起月經(jīng)不調(diào)、性交痛、不孕等癥狀,雖為良性疾病,但具有增生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的特點(diǎn),病情遷延,嚴(yán)重影響婦女的身心健康及家庭幸福。研究人員雖已對(duì)EMS進(jìn)行了多方面的研究,但其發(fā)病機(jī)制仍眾說(shuō)紛紜,沒(méi)有定論。其中,子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)是EMS發(fā)病的主導(dǎo)理論,認(rèn)為脫落的子宮內(nèi)膜碎片由輸卵管流入腹腔,種植在盆腔臟器表層而形成病灶。但流入腹腔的內(nèi)膜組織必須降解基底膜及其他細(xì)胞外基質(zhì)成分才能完成種植。MMP是催化細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要酶類(lèi)之一,幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。其中,MMP-9是降解細(xì)胞外基質(zhì)最重要的酶類(lèi)之一,它參與了細(xì)胞外基質(zhì)主要成分IV型膠原的降解,并能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽以及新生血管形成,促進(jìn)EMS異位內(nèi)膜的形成和生長(zhǎng)。而TIMP則是一類(lèi)蛋白酶抑制劑,能抑制MMP的活性。其中,TIMP-1能夠與活化的MMP-9形成復(fù)合物而抑制其活性,降低細(xì)胞外基質(zhì)的降解,抑制新生血管形成。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),EMS患者異位內(nèi)膜可表現(xiàn)出MMP-9表達(dá)增強(qiáng),而TIMP-1表達(dá)降低,細(xì)胞外基質(zhì)降解增多,導(dǎo)致異位內(nèi)膜侵襲性生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,模型大鼠異位子宮內(nèi)膜組織MMP-9mRNA的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)(P<0.01),而TIMP-1mRNA的表達(dá)則明顯低于假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)(P<0.01),這與臨床研究結(jié)果相吻合,說(shuō)明MMP-9/TIMP-1比例的升高與EMS的發(fā)病密切相關(guān)。丹莪婦康煎膏為臨床治療EMS的常用中藥,是由紫丹參、莪術(shù)、竹葉柴胡、三七等中藥組方而成,具有活血化瘀、疏肝理氣、調(diào)經(jīng)止痛、軟堅(jiān)化積等功效。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn),丹莪婦康煎膏對(duì)EMS模型大鼠有較好治療作用,但作用機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)采用子宮內(nèi)膜自體移植法建立大鼠EMS模型