熒光分光光度計(jì)法測(cè)定麗娃河

熒光分光光度計(jì)法測(cè)定麗娃河水體中葉綠素實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名：畢倩倩學(xué)號(hào)：51102601010專業(yè)：海洋化學(xué)指導(dǎo)老師：高磊實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鉄晒夥止夤舛扔?jì)儀器的原理及用途掌握本實(shí)驗(yàn)葉綠素測(cè)定的原理及簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)操作熒光分光光度計(jì)儀器組成及原理熒光分光光度計(jì)儀器主要由以下5個(gè)組成部分：光源：為高壓汞蒸氣燈或氙弧燈，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在300nm?400nm范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用。>激發(fā)單色器：置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。發(fā)射單色器：置于樣品室和檢測(cè)器之間的為發(fā)射單色器或第二單色器，常采用光柵為單色器。篩選出特定的發(fā)射光譜。樣品室：通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。測(cè)量液體時(shí)，光源與檢測(cè)器成直角安排；測(cè)量固體時(shí)，光源與檢測(cè)器成銳角安排。>檢測(cè)器：一般用光電管或光電倍增管作檢測(cè)器?？蓪⒐庑盘?hào)放大并轉(zhuǎn)為電信號(hào)。工作原理：由高壓汞燈或氙燈發(fā)出的紫外光和藍(lán)紫光經(jīng)濾光片照射到樣品池中，激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，熒光經(jīng)過(guò)濾過(guò)和反射后，被光電倍增管所接受，然后以圖或數(shù)字的形式顯示出來(lái)。物質(zhì)熒光的產(chǎn)生是由在通常狀況下處于基態(tài)的物質(zhì)分子吸收激發(fā)光后變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)這些處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，在返回基態(tài)的過(guò)程中將一部分的能量又以光的形式放出，從而產(chǎn)生熒光。不同物質(zhì)由于分子結(jié)構(gòu)的不同,其激發(fā)態(tài)能級(jí)的分布具有各自不同的特征，這種特征反映在熒光上表現(xiàn)為各種物質(zhì)都有其特征熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，因此可以用熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的不同來(lái)定性地進(jìn)行物質(zhì)的鑒定。在溶液中，當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較低時(shí)，其熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度通常有良好的正比關(guān)系，即IF=KC，利用這種關(guān)系可以進(jìn)行熒光物質(zhì)的定量分析。實(shí)驗(yàn)原理在自然水體中，葉綠素存在于浮游植物的細(xì)胞當(dāng)中，其含量能夠反映水體中浮游植物的數(shù)量。水樣采集之后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾，將浮游植物附著在濾膜之上。再經(jīng)過(guò)90%丙酮萃取，最后定容，測(cè)定萃取液中的葉綠素濃度。本次實(shí)驗(yàn)利用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定葉綠素濃度。它采用430nm的紫外光光源照射葉綠素樣品，從而激發(fā)葉綠素產(chǎn)生熒光，所產(chǎn)生的熒光越強(qiáng)，葉綠素的濃度也越高，二者成線性正相關(guān)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作可得出葉綠素濃度與光強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。通過(guò)這種對(duì)應(yīng)關(guān)系確定葉綠素計(jì)算公式中的待定系數(shù)。最后根據(jù)葉綠素濃度公式和待測(cè)樣品所得出熒光值即可計(jì)算出。另外，葉綠素的測(cè)定中需要添加酸化步驟。這是因?yàn)槌巳~綠素以外還有其他物質(zhì)被萃

取到丙酮中，在受到紫外光照射時(shí)它們也可能產(chǎn)生熒光。加酸后，可以破壞掉所有的葉綠素，再測(cè)定熒光強(qiáng)度，用酸化前的減去酸化后的數(shù)值所得出的即為葉綠素所占的部分。實(shí)驗(yàn)儀器及材料熒光分光光度計(jì)(日立F-2500)過(guò)濾裝置(含手泵)移液槍5ml、1ml石英皿、擦鏡紙塑料樣品管parafilm膜2張0.7pmwhatmanGF/F膜鑷子量筒麗娃河水500ml丙酮10%HCl溶液實(shí)驗(yàn)步驟(1)用鑷子加入1張0.7pmwhatmanGF/F膜于過(guò)濾裝置的濾芯上，擰好白色塑料圈，取250ml麗娃水倒入過(guò)濾裝置，用手泵減壓，使水樣通過(guò)濾膜過(guò)濾，至膜表面干即可。打開(kāi)白色塑料圈，將過(guò)濾好的濾膜折疊好加到塑料樣品管中，且放入底部，加入5ml丙酮，蓋上蓋子，震蕩10-15s，攪拌均勻。用parafilm膜封住蓋口，寫(xiě)好標(biāo)簽。另在重復(fù)一次操作。結(jié)束后，將樣品管放置在冰箱中冷凍。(2)24h后，將兩個(gè)樣品管取出，震蕩10-15s，用Milli-Q水潤(rùn)洗石英皿3遍，用(2)1ml移液槍去上層清液2ml，用擦鏡紙拭干石英皿表面水，放入儀器的樣品池中，上機(jī)測(cè)量。儀器的設(shè)置為:Response:2.0sEMEndML:685nmResponse:2.0sEMEndML:685nmReplicate:3Scanspeed:300nm/mincycletime:0minDelay:20sEX:10nmdatamode:fluorescenceEm:215nmExWL:430nmPMTVoltage:700VEMstartML:660nm測(cè)試完，讀取3個(gè)數(shù)據(jù)，然后向石英皿中滴加一滴10%HCl溶液，再測(cè)量，讀取3個(gè)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論Samplel：酸化前三次數(shù)據(jù)：163.5、160.7、162.3平均值：162.17酸化后三次數(shù)據(jù)：72.66、73.39、72.64平均值：72.90Sample2：酸化前三次數(shù)據(jù)：169.1、169.9、170.2平均值：169.73酸化后三次數(shù)據(jù)：73.82、73.82、72.30平均值：73.31chl-achl-a(ug/L)=x(F-F)xKxx0'Vol}VolXVfilt)其中Fm：酸化比，取Fm=2.2Fo：加酸前3次讀數(shù)平均值Fa：加酸后3次讀數(shù)平均值Kx：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，取Kx=1.9086Volex:萃取體積，取Volex=5.8mlVolfilt：過(guò)濾體積，單位與Volex一致，也為ml討論：可以看出兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)Sample1和Sample2計(jì)算出來(lái)的葉綠素的值相差不是很大，平均值為7.537mg/L，計(jì)算出來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%，這可能是由于實(shí)驗(yàn)誤差或者系統(tǒng)誤差導(dǎo)致的。目前水體富營(yíng)養(yǎng)化一般采用的指標(biāo)是：水體中氮含量超過(guò)0.2-0.3ppm，生化需氧量大于10ppm，磷含量大于0.01-0.02ppm，pH值7-9的淡水中細(xì)菌總數(shù)每