薄層色譜小知識(shí)

薄層色譜小知識(shí)選擇適當(dāng)?shù)恼归_(kāi)劑是首要任務(wù).一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷＜己烷＜苯＜乙醚＜THF＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇使用單一溶劑，往往不能達(dá)到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個(gè)高極性和低級(jí)性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區(qū)分度的作用，展開(kāi)劑的比例要靠嘗試.一般根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的該類(lèi)化合物用什么樣的展開(kāi)劑，就首先嘗試使用該類(lèi)展開(kāi)劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個(gè)分離效果好的展開(kāi)劑。展開(kāi)劑的選擇條件：①對(duì)的所需成分有良好的溶解性；②可使成分間分開(kāi)；③待測(cè)組分的Rf在0.2~0.8之間，定量測(cè)定在0.3?0.5之間；④不與待測(cè)組分或吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；⑤沸點(diǎn)適中，黏度較??；⑥展開(kāi)后組分斑點(diǎn)圓且集中；⑦混合溶劑最好用新鮮配制。一般來(lái)說(shuō)，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據(jù)需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯來(lái)調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，以達(dá)到好的分離效果，適合于生物堿、黃酮、萜類(lèi)等的分離；中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來(lái)調(diào)節(jié)，適合于蒽醌、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和萜類(lèi)的分離；強(qiáng)極性溶劑，由正丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來(lái)調(diào)節(jié)，適合于極性很大的生物堿類(lèi)化合物的分離。很多時(shí)候,展開(kāi)劑的選擇要靠自己不斷變換展開(kāi)劑的組成來(lái)達(dá)到最佳效果。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中，為了實(shí)現(xiàn)一個(gè)配體與其他雜質(zhì)有效分離，曾經(jīng)嘗試了很多種的溶劑組合，最后才找到石油醚一EtOAc—HCOOH（5.5：3.5：0.1）混合溶劑。一般把兩種溶劑混合時(shí)，采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑，如果有分開(kāi)的跡象，再調(diào)整比例（或者加入第三種溶劑），達(dá)到最佳效果；如果沒(méi)有分開(kāi)的跡象（斑點(diǎn)較“拖”），最好是換溶劑。對(duì)于在硅膠中這種酸性物質(zhì)上易分解的物質(zhì)，在展開(kāi)劑里往往加一點(diǎn)點(diǎn)三乙胺，氨水，毗啶等堿性物質(zhì)來(lái)中和硅膠的酸性。（選擇所添加的堿性物質(zhì)，還必須考慮容易從產(chǎn)品中除去，氨水無(wú)疑是較好的選擇。）分離效果的好壞和所用硅膠和溶劑的質(zhì)量很有關(guān)系：不同廠家生產(chǎn)的硅膠可能含水量以及顆粒的粗細(xì)程度，酸性強(qiáng)弱不同，從而導(dǎo)致產(chǎn)品在某個(gè)廠家的硅膠中分離效果很好，但在另一個(gè)廠家的就不行。溶劑的含水量和雜質(zhì)含量對(duì)分離效果都有明顯的影響。溫度，濕度對(duì)分離效果影響也很明顯，在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)有時(shí)同一展開(kāi)條件，上下午的Rf截然不同。展開(kāi)劑的選擇主要根據(jù)樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素來(lái)考慮，在進(jìn)行薄層層析時(shí)，首先應(yīng)該知道未知化學(xué)成分的類(lèi)型，其極性的大致歸屬，從提取液或從色譜柱的流動(dòng)相極性可知，另外某樣品里含多種化學(xué)成分先按極性不同大致分，然后細(xì)分，對(duì)于分離未知的化學(xué)物質(zhì)，展開(kāi)劑的選擇也是一個(gè)摸索的過(guò)程，不應(yīng)該僅僅從展開(kāi)劑考慮，多因素綜合衡量！溶劑：層析過(guò)程中溶劑的選擇，對(duì)組分分離關(guān)系極大。在柱層析時(shí)所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習(xí)慣上稱(chēng)洗脫劑，用于薄層或紙層析時(shí)常稱(chēng)展開(kāi)劑。洗脫劑的選擇，須根據(jù)被分離物質(zhì)與所選用的吸附劑性質(zhì)這兩者結(jié)合起來(lái)加以考慮在用極性吸附劑進(jìn)行層析時(shí)，當(dāng)被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì)，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質(zhì)為強(qiáng)極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對(duì)某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應(yīng)降低。在柱層操作時(shí)，被分離樣品在加樣時(shí)可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應(yīng)選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個(gè)十分緩慢的過(guò)程，稱(chēng)為“梯度洗脫”，使吸附在層析柱上的各個(gè)成分逐個(gè)被洗脫。如果極性增大過(guò)訣（梯度太大），就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時(shí)可以用溶劑的介電常數(shù)3）來(lái)表示。介電常數(shù)高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化鋁。對(duì)非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強(qiáng)。被分離物質(zhì)的性質(zhì)被分離的物質(zhì)與吸附劑，洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析中的三個(gè)要素，彼此緊密相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個(gè)成分的分離情況，直接與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關(guān)。對(duì)極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附住強(qiáng)。當(dāng)然，中草藥成分的整體分子觀是重要的，例如極性基團(tuán)的數(shù)目愈多，被吸附的住能就會(huì)更大些，在同系物中碳原子數(shù)目少些，被吸附也會(huì)強(qiáng)些?？傊?，只要兩個(gè)成分在結(jié)構(gòu)上存在差別，就有可能分離，關(guān)鍵在于條件的選擇。要根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，吸附劑的吸附強(qiáng)度，與溶劑的性質(zhì)這三者的相互關(guān)系來(lái)考慮。首先要考慮被分離物質(zhì)的極性。如被分離物質(zhì)極性很小為不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團(tuán)，則需選用吸附性較強(qiáng)的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進(jìn)行洗脫。但多數(shù)中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般III?W級(jí)）。采用的洗脫劑極性應(yīng)由小到大按某一梯度遞增，或可應(yīng)用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統(tǒng)中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，還與選擇的溶劑梯度有很大關(guān)系?，F(xiàn)以實(shí)例說(shuō)明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之間的關(guān)系。如有多組分的混合物，象植物油脂系由烷烴、烯烴、舀醇酯類(lèi)、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。如對(duì)于C-27甾體皂甙元類(lèi)成分，能因其分字中羥基數(shù)目的多少而獲得分離：將混合皂甙元溶于含有5%氯仿的苯中，加于氧化鋁的吸附柱上，采用以下的溶劑進(jìn)行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁，由于硅酸鎂的吸附性較弱，洗脫劑的極牲需相應(yīng)降低，亦即采用苯或含5%氯仿的苯，即可將一元羥基皂甙元從吸附劑上洗脫下來(lái)。這一例子說(shuō)明，同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時(shí)，需用不同的溶劑才能達(dá)到相同的分離效果，從而說(shuō)明吸附劑、溶劑和欲分離成分三者的相互關(guān)系。（二）簿層層析：薄層層析是一種簡(jiǎn)便、快速、微量的層析方法。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進(jìn)行層析時(shí)一即稱(chēng)薄層層析。其原理與柱層析基本相似。薄層層析的特點(diǎn)：薄層層析在應(yīng)用與操作方面的特點(diǎn)與柱層析的比較。吸附劑的選擇：薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同。主要區(qū)別在于薄層層析要求吸附劑（支持劑）的粒度更細(xì)，一般應(yīng)小于250日，并要求粒度均勻。用于薄層層析的吸附劑或預(yù)制薄層一般活度不宜過(guò)高，以II?III級(jí)為宜。而展開(kāi)距離則隨薄層的粒度粗細(xì)而定，薄層粒度越細(xì)，展開(kāi)距離相應(yīng)縮短，一般不超過(guò)10厘米，否則可引起色譜擴(kuò)散影響分離效果。展開(kāi)劑的選擇：薄層層析，當(dāng)吸附劑活度為一定值時(shí)（如I或III級(jí)），對(duì)多組分的樣品能否獲得滿意的分離，決定于展開(kāi)劑的選擇。中草藥化學(xué)成分在脂溶性成分中，大致可按其極性不同而分為無(wú)極性、弱極性、中極性與強(qiáng)極性。但在實(shí)際工作中，經(jīng)常需要利用溶劑的極性大小，對(duì)展開(kāi)劑的極性予以調(diào)整。1、怎樣提高點(diǎn)樣效率？點(diǎn)樣是造成TLC定量誤差的主要來(lái)源。實(shí)驗(yàn)證明：定量毛細(xì)管更適合較小體積的點(diǎn)樣；微量注射器更適合較大體積的點(diǎn)樣。這主要是因?yàn)槲⒘孔⑸淦魇苄馀荨⑷芤夯嘏垃F(xiàn)象的影響較大。為避免不同定量毛細(xì)管理體制的占樣誤差，建議一塊薄層板上最好用同一只定量毛細(xì)管。但應(yīng)注意更換樣品時(shí)，應(yīng)將毛細(xì)管用超聲波或不同極性溶課劑清洗干凈。在制備樣品時(shí)，溶樣溶劑黏度不能過(guò)高，以便于點(diǎn)樣；溶劑沸點(diǎn)過(guò)低則進(jìn)樣體積易變，過(guò)高則會(huì)改變展開(kāi)劑組成；對(duì)樣品溶解度過(guò)高會(huì)使樣點(diǎn)發(fā)生空心現(xiàn)象，常用的溶劑為甲醇、乙醇、丙酮。經(jīng)典TLC樣點(diǎn)原點(diǎn)一般為直徑3mm點(diǎn)間距離1-2cm底邊距離1.5cm;HPLC樣點(diǎn)原點(diǎn)一般為直徑1mm點(diǎn)間距5mm底邊距1cm.2、 展開(kāi)劑的選擇TLC與HPLC相比，一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)就是流動(dòng)相的選擇具有更大的靈活性，流動(dòng)相的選擇的目的是使絕大部分樣品的Rf值位于0.1—0.7之間并達(dá)到較好的分離，與此對(duì)應(yīng)的是流動(dòng)相要有適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度和組成。流動(dòng)相強(qiáng)度越大，溶質(zhì)Rf值越大，但很可能降低分離能力；另外單一溶劑很難分離較復(fù)雜的混合物、根據(jù)相似相溶原理，要使用多元溶劑體系。一般展開(kāi)劑體系選擇如下：根據(jù)分離樣品性質(zhì)、薄層色譜板性質(zhì)選擇一個(gè)二元溶劑體系，通過(guò)調(diào)節(jié)溶劑比例以尋求適合Rf值，適合的Rf值找到后，再尋求極性參數(shù)相同的二元溶劑體系兩個(gè)，以這三個(gè)組成為三點(diǎn)組成一個(gè)三角形，則可看到：三角形頂點(diǎn)是二元體系，邊是三元體系，三角形內(nèi)是四元體系，并且極性一致，可根據(jù)幾何原理得出任一點(diǎn)組成，這種方法較為直觀，也較簡(jiǎn)單。3、 TLC的通用顯色方法理想的顯色希望靈敏度高，斑點(diǎn)顏色穩(wěn)定、斑點(diǎn)與背景間的對(duì)比度好，斑點(diǎn)的大小及顏色的深度與物質(zhì)的量成正比，在樣品組成并不完全已知的情況下，通用顯色方法顯得尤為重要，通用顯色方法主要有：1、 紫外照射法：方便、不破壞樣品；2、 碘蒸氣法：通用性強(qiáng)，與紫外法結(jié)合靈敏度高于該兩法單獨(dú)使用；3、 熒光試劑：制造熒光背景，使原來(lái)紫外下無(wú)熒光物質(zhì)被鑒別，有熒光物質(zhì)更明顯;4、硫酸溶劑：對(duì)絕大多數(shù)有機(jī)物有效，但有破壞性?？梢杂霉枘zGF254鋪板，然后在紫外254下觀察。如果顯色劑是溶液，那么可以用一個(gè)噴霧小瓶噴在薄層板上。具體用什么顯色劑可以查一下文獻(xiàn)。顯色的除了碘是常用的之外，還有就是硫酸，只要