蛋白質(zhì)分離純化2014.7

蛋白質(zhì)的分離純化2014-07-17蛋白質(zhì)純化的一般注意事項

1、操作盡可能在低溫下進行。

2、蛋白濃度要合適，蛋白濃度維持在μg/mL～mg/mL。

3、合適的pH。

4、避免樣品反復(fù)凍融和劇烈攪動。

6、在緩沖溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（β-巰基乙醇）

7、加1~10mmol/LEDTA金屬螯合劑蛋白質(zhì)性質(zhì)蛋白質(zhì)分離純化方法溶解度鹽析，有機溶劑沉淀等大小、形狀透析、凝膠過濾層析密度密度梯度離心帶電荷（等電點）離子交換層析，電泳分子形狀、大小和凈電荷凝膠電泳（變性/非變性）吸附性質(zhì)吸附層析疏水性質(zhì)疏水層析/反相HPLC與配體的親和力親和層析能用作蛋白質(zhì)純化依據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì)+++++++（1）蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素電荷層：蛋白質(zhì)在非等電點狀態(tài)時帶電荷，在顆粒表面形成電荷層，不同分子間同性電荷互斥，使分子不能聚集。水化層：可溶性蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒表面形成水化層，其可防止蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀。（2）蛋白質(zhì)的沉淀pH，離子強度和性質(zhì)，溶劑的極性鹽析法:有機溶劑沉淀法：等電點沉淀法：有機酸：聚乙二醇：鹽析法:

大量的中性鹽（(NH4)2SO4），使蛋白質(zhì)脫去水化膜而聚集沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀方法鹽離子會跟蛋白質(zhì)表面爭奪水分子，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，以至于蛋白質(zhì)表面疏水性區(qū)域傾向于結(jié)合，而沉淀下來在蛋白質(zhì)的鹽析中，以硫酸銨最為常用。溶解度大溫度系數(shù)小(在25℃時，溶解度為767g／L；0℃時，溶解度為697g／L)、不使蛋白質(zhì)變性價廉易得鹽析的操作1、鹽的處理：硫酸銨使用時要求純度較高，應(yīng)用分析純。2、加鹽的方法（1）直接加入固體硫酸銨法（2）加入飽和硫酸銨溶液法在攪拌下緩慢均勻加入，避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。一般硫酸銨全部加完后，應(yīng)放置30min以上才可更好的進行固-液分離。沉淀獲得的蛋白質(zhì)里含有較多的硫酸銨，需脫鹽。①pH值對鹽析的影響：蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大。因此用沉淀蛋白質(zhì)時，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近。②蛋白質(zhì)的濃度：比較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.5％～3.0％，相當于25mg/mL～30mg/mL。蛋白質(zhì)濃度過高，除雜蛋白的效果會明顯下降；濃度過低，則最后蛋白質(zhì)的回收率低。鹽析注意事項硫酸銨濃度的確定把樣品分成五份，每份分別加硫酸氨至20%，30%，40%，50%，60%，離心去掉沉淀，保留上清向上清里面添加硫酸氨使?jié)舛葟?0%到30%，30%到40%，40%到50%，50%到60%，60%到70%，離心保留沉淀，然后分析沉淀里的蛋白，看看目的蛋白在哪個濃度里分段鹽析：使用不同濃度的硫酸銨溶液可將不同的蛋白質(zhì)進行初步分離

利用透析袋（半透膜）把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。半透膜阻留pr分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）透析(dialysis)商品透析袋為防干裂，出廠時都用10％的甘油處理過，并含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì)，實驗時依次用50％乙醇、0.01mol/L碳酸氫鈉和0.001mol/LEDTA溶液煮沸，最后用蒸餾水沖洗。（直接沸水煮五至十分鐘，再用蒸餾水洗凈）。透析卡蛋白質(zhì)顆粒沉降不僅決定于它的大小也取決于它的密度。顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)梯度時，即停止不前。在離心力的作用下，各種蛋白質(zhì)在不同密度介質(zhì)中形成獨立的區(qū)帶。聚蔗糖密度梯度氯化銫密度梯度離心依據(jù)密度的純化方法密度梯度制備和分離的新時代蛋白質(zhì)化學中的層析技術(shù)

層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”。

1941年，英國生物學家Martin和Synge首先提出了色譜塔板理論，為后來各種色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。該技術(shù)的使用使得化學、生物學和醫(yī)學的研究得到迅速的發(fā)展。

一、層析技術(shù)原理層析技術(shù)是利用混合物在互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的差異，而將它們分離的方法。層析系統(tǒng)固定相：固定在支持介質(zhì)上(如硅膠、樹脂等)

可以是液體，固體，固液混合流動相：可自由流動

液體、氣體在流動相流經(jīng)固定相的過程中，由于各組分在兩相溶劑中的作用情況不同（電荷、離子親和力、溶解度、疏水作用力等），而以不同的速度前進，從而達到分離的目的。

二、層析的分類1.按固定相基質(zhì)的形式：紙層析、薄層層析、柱層析柱中填充不溶的基質(zhì)顆粒，常用的有葡聚糖，樹脂等

2.根據(jù)流動相的形式：液相層析、氣相層析

凝膠過濾原理吸附層析疏水層析親和層析離子交換3.根據(jù)分離的原理不同分類三、柱層析基本操作過程

裝置上樣和洗脫結(jié)果檢測

上樣均一性洗脫方法目的不同檢測方法不同活性檢測柱層析的L/d比值1、柱層析的L/d比值根據(jù)層析的基質(zhì)和分離目的而定。一般柱子的直徑與長度比為1:10~50；凝膠柱可以選1:100~200基質(zhì)的處理將層析用的基質(zhì)（如吸附劑、樹脂、凝膠等）在適當?shù)娜軇┗蚓彌_液中溶脹，并用適當濃度的酸（0.5N~1N）、堿（0.5N~1N）或鹽（0.5M~1M）溶液洗滌處理，以除去其表面可能吸附的雜質(zhì)。然后用去離子水（或蒸餾水）洗滌干凈并真空抽氣（吸附劑等與溶液混合在一起），以除去其內(nèi)部的氣泡裝柱關(guān)閉層析柱出水口，并裝入1/3柱高的緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢地倒入柱中，使其沉降約3cm高。打開出水口，控制適當流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液。注意不能干柱、分層、氣泡，否則必須重新裝柱。最后使柱中基質(zhì)表面平坦并在表面上留有2~3cm高的緩沖液，同時關(guān)閉出水口。檢測柱效

柱子裝好后，要用所需的緩沖液平衡柱子。用藍色葡聚糖過柱，如色帶均勻下降，則說明柱子是均勻的（凝膠過濾層析）。平衡平衡液體積一般為3~5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。2

、加樣

加樣量的多少直接影響分離的效果。加樣量少些，分離效果比較好。通常加樣量應(yīng)少于20%的操作容量體積應(yīng)低于5%的床體積，對于分析性柱層析，一般不超過床體積的1%。加樣時應(yīng)緩慢小心地將樣品溶液加到基質(zhì)表面，盡量避免沖擊基質(zhì)，以保持基質(zhì)表面平坦。3、洗脫

（1）不改變?nèi)軇w系

（簡單洗脫）柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結(jié)束為止。

改善：蠕動泵或恒流泵維持流速恒定的簡易裝置

（2）改變?nèi)軇┫到y(tǒng)分步洗脫

在一個溶劑系統(tǒng)洗滌后，改用另一溶劑系統(tǒng)。

梯度洗脫當混合物中組分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強度或pH值等。樣品收集、鑒定及保存圖譜保存記錄儀繪制的圖譜監(jiān)測用紫外檢測儀進行，在280nm處觀察洗脫液的光吸收收集用分布收集器收集，可以自動收集，也可以手動收集鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳、測定活性等

許多基質(zhì)（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）可以反復(fù)使用多次，而且價格昂貴，所以層析后要回收處理，以備再用?；|(zhì)的再生和保存離子交換層析IonExchangeChromatography離子交換層析是利用離子交換基質(zhì)上的可解離基團對各種蛋白結(jié)合力不同而達到分離目的的一種分離方法支持基質(zhì)：纖維素，瓊脂糖——CH2COO-Na+——DEAE+Cl-活性基團：陽離子：羧甲基（CM）陰離子：二乙基氨基乙基（DEAE）由于蛋白質(zhì)分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行蛋白的分離純化。陽離子交換層析原理洗脫方法：改變鹽濃度和改變pH的方法

+離子交換劑的基質(zhì)

瓊脂糖離子交換劑

離子交換交聯(lián)葡聚糖聚苯乙烯離子交換纖維素

1、交聯(lián)葡聚糖類

型性

能離子基因反離子DEAE-sephadexA-25弱堿性、陰離子交換劑DEAE+Cl—DEAE-sephadexA-50QAE-sephadex-25弱堿性、陰離子交換劑QAE+Cl—QAE-sephadexA-50CM-A-sephadex25弱堿性、陽離子交換劑CM—Na+CM-sephadexA-50SP-sephadexA-25強堿性、陽離子交換劑SP—Na+SP-sephadexA-50交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）開放性長鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際交換容量要比離子交換樹脂大的多。親水性，對蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質(zhì)的變性和失活。

回收率高優(yōu)點：2、離子交換纖維素

離子交換纖維素種類交換劑名

稱（纖維素）作用基團特

點陰離子交換劑二乙氨基乙基DEAE+

Cl-最常用在pH8.6以下氨乙基AE+

Cl-胍乙基強堿性、極高pH仍有效陽離子交換劑羧甲基CM－Na+最常用在pH4以上磷酸P－Na+

用于低pH磺甲基SM－Na+磺乙基SE－Na+強酸性用于極低pH四、基本操作

緩沖液的選擇層析柱的選擇

洗脫流速↓↙加樣洗脫洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定離子交換劑的清洗、再生和保存

↓↓↓←離子交換劑的處理

↘↑離子交換劑的選擇2、離子交換劑的處理酸堿浸泡使離子交換劑帶上需要的平衡離子，一般陽離子交換劑最后用堿NaOH處理，陰離子交換劑最后用酸HCl處理。

膨化將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的配基充分暴露出來。水懸浮去除雜質(zhì)和細小顆粒5、上樣樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強度離子強度應(yīng)低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。

6、洗脫改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強度

洗脫方法階段洗脫和梯度洗脫

再生

對使用過的離子交換劑進行處理，使其恢復(fù)原來性狀的過程。

酸堿交替浸泡保存處理洗凈蛋白等雜質(zhì)后，加入適當?shù)姆栏瘎?，一般加?.02%的疊氮鈉，4°C下保存。凝膠過濾層析（gelfiltrationchromatography）凝膠顆粒為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚合物。凝膠過濾層析又稱分子篩過濾、分子排阻層析等，根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來分離純化蛋白質(zhì)葡聚糖（Sephadex）聚丙烯酰胺凝膠（Bio-GelP）瓊脂糖凝膠（Sepharose,Bio-GelA）交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）凝膠過濾層析的原理凝膠過濾層析的原理是分子篩效應(yīng)，小分子可以進入凝膠網(wǎng)孔，而大分子則排阻于顆粒之外。如同過篩那樣，它可以把蛋白質(zhì)按不同分子大小進行分離。2、影響分離效果的因素流速加樣體積樣品濃度離子強度①流速

影響洗脫液流速的因素洗脫液加在柱上的壓力

為保持層析過程中恒定的壓力，可使用恒壓瓶。凝膠顆粒大小

②加樣體積上樣體積為柱體積應(yīng)合適體積過大

洗脫峰和相鄰峰重疊體積過小目的蛋白收集量少、稀釋倍數(shù)大、濃度低③樣品濃度進樣前，樣品一般為10～20mg/mL粗分離&脫鹽除雜適當提高樣品濃度精細分離&分析性實驗濃度低④離子強度可防止蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間或與凝膠介質(zhì)之間的相互作用常用鹽溶液：

20-100mmol/LNaCl二、凝膠過濾層析的介質(zhì)

葡聚糖系列瓊脂糖系列聚丙烯酰胺系列多孔硅膠葡聚糖系列以微生物產(chǎn)生的葡聚糖苷Dextran為原料用環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑，在堿性條件下交聯(lián)而成商品的凝膠，稱為Sephadex先制成丙烯基的衍生物，然后再用N，N’-甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)，得到商品化的凝膠，被稱為SephacrylSephadexG-X，X表示葡聚糖的交聯(lián)程度，數(shù)值越大則交聯(lián)度越小，但吸水量越高。四、凝膠過濾層析的應(yīng)用

脫鹽，分離提純高分子溶液的濃縮測定高分子物質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)復(fù)性研究

logMr

=K1-

K2Ve洗脫體積Ve：自加入樣品開始到該組分的洗脫峰峰頂（即收集液中該組分濃度最大時）出現(xiàn)時所流出的洗脫液體積。凝聚過濾法測定蛋白質(zhì)分子量高分子溶液的濃縮將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物質(zhì)就會進入凝膠粒子內(nèi)部高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外