《食品分析》課件-第十章 維生素的測(cè)定

第十章

維生素的測(cè)定1【教學(xué)目標(biāo)與要求】1.教學(xué)目標(biāo)：能夠根據(jù)不同測(cè)定方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)常用維生素能夠正確測(cè)定其含量。2.教學(xué)要求：通過本章學(xué)習(xí)，要求學(xué)生了解維生素對(duì)人體健康的重要性。理解脂溶性維生素和水溶性維生素的處理方法，掌握VA、VD、VE和VB1、VC的測(cè)定方法?！窘虒W(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)】1.教學(xué)重點(diǎn)：維生素A、D、C的測(cè)定原理及方法。2.教學(xué)難點(diǎn)：維生素A、D、C不同測(cè)定方法的樣品預(yù)處理方法?！窘虒W(xué)內(nèi)容】§10-1概述§10-2脂溶性維生素的測(cè)定1.

HPLC法測(cè)定食物中VA、VE的含量2.比色法測(cè)定維生素A的含量§10-3水溶性維生素的測(cè)定1.維生素B1的測(cè)定2.維生素C的測(cè)定§10-1概述

維生素是維持人體正常生命活動(dòng)所必需的一類天然有機(jī)化合物。其種類很多，目前已確認(rèn)的有30余種，其中被認(rèn)為對(duì)維持人體健康和促進(jìn)發(fā)育至關(guān)重要的有20余種。這些維生素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，理化性質(zhì)及生理功能各異，有的屬于醇類，有的屬于胺類，有的屬于酸類，還有的屬于酚或醌類化合物。4維生素都具有以下共同特點(diǎn)：1.化合物或其前體化合物都在天然食物中存在；2.它們不能供給機(jī)體熱能。也不是構(gòu)成組織的基本原料，主要功用是通過作為輔酶的成份調(diào)節(jié)代謝過程，需要量極??；3.它們一般在體內(nèi)不能合成，或合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)常從食物中攝?。?.長(zhǎng)期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。5

我們?cè)谠u(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，開發(fā)利用高含量維生素的食品資源，指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)，指導(dǎo)制定加工工藝或貯存條件，最大限量地保留各種維生素，還要控制強(qiáng)化食品中加入量，防中毒，都離不開分析檢測(cè)工作。維生素分類：脂溶性（A、D、E、K）水溶性兩類（B族、C）67第二節(jié)脂溶性V的測(cè)定VA、VD、VE與類脂物一起存于食物中，攝食時(shí)可吸收，可在體內(nèi)積貯。

脂溶性維生素具有以下理化性質(zhì)：

1．溶解性：脂溶性維生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑。

2．耐酸堿性：維生素A、D對(duì)酸不穩(wěn)定，對(duì)堿穩(wěn)定，維生素E對(duì)堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下或惰性氣體保護(hù)下，也能經(jīng)受堿的煮沸。8

3．耐熱性、耐氧化性：耐熱性氧化性VA

好，能經(jīng)受煮沸易被氧化

（光、熱促進(jìn)其氧化）VD好，能經(jīng)受煮沸不易被氧化

VE好，能經(jīng)受煮沸在空氣中能慢慢被氧化（光、熱、堿促進(jìn)其氧化）9

根據(jù)上述性質(zhì)．測(cè)定脂溶性維生素時(shí)，通常：皂化樣品水洗去除類脂物有機(jī)溶劑提取脂溶性維生素(不皂化物)濃縮溶于適當(dāng)?shù)娜軇y(cè)定。

在皂化和濃縮時(shí)，為防止維生素的氧化分解，常加入抗氧化劑(如焦性沒食子酸、維生素C等)。對(duì)于A、D、E共存的樣品，或雜質(zhì)含量高的樣品，在皂化提取后，還需進(jìn)行層析分離。10國(guó)際單位：

IU（InternationalUnit)

1IU=0.3μgVA=0.025VD=1.79μgβ-胡蘿卜素=1.1mgα-VE=3μgVB一、維生素A的測(cè)定

維生素A存在于動(dòng)物性脂肪中，主要來(lái)源于肝臟、魚干油、蛋類、乳類等動(dòng)物性食品中。植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡蘿卜素，它在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)閂A，故稱為VA原。

1112思考題1、高效液相色譜法測(cè)定食物中VA、VE的原理？樣品處理方法？測(cè)定步驟？2、高效液相色譜法測(cè)定食物中VA、VE的樣品皂化的流程、用具、試劑？3、高效液相色譜法測(cè)定食物中VA、VE的樣品提取的流程、用具、試劑？4、高效液相色譜法測(cè)定食物中VA、VE的樣品濃縮的流程、用具、試劑？5、比色法測(cè)定VA的原理？樣品處理方法？測(cè)定步驟？6、三氯化銻比色法測(cè)定VD的原理？7、液相色譜法測(cè)定VD的原理？8、熒光法測(cè)維生素B1的原理？樣品處理方法？測(cè)定步驟？9、2，6—二氯靛酚滴定法測(cè)維生素C的原理？樣品處理方法？測(cè)定步驟？10、熒光法測(cè)維生素C的原理？一、高效液相色譜法測(cè)定食物中VA、VE

（GB5009.82—2016）

高效液相色譜法測(cè)定維生素A能快速分離和測(cè)定視黃醇和它的同分異構(gòu)體、酯及其衍生物。

原理：試樣中的維生素A及維生素E經(jīng)皂化(含淀粉先用淀粉酶酶解)、提取、凈化、濃縮后,C30或PFP反相液相色譜柱分離,紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器檢測(cè),外標(biāo)法定量。14正相柱和反相柱區(qū)別在于固定鍵合相的不同,如果反了那么柱子可能會(huì)壞,因?yàn)樗麄冎g的色譜系統(tǒng)不同.

正相和反相是通過比較流動(dòng)相與固定性極性大小而定義的

固定性極性小于流動(dòng)相，即為反相柱，反之，為正相柱。

一般，大部分用的是反相柱，可以分離大部分的化學(xué)成分，流動(dòng)相也含有水分。而正相柱，流動(dòng)相只能為有機(jī)溶劑，切不能用含水溶劑，否則柱子就要廢了。反相柱（reversedphasecolumn）：填料是非極性的，官能團(tuán)為烷烴，例如：C18(ODS)、C8、C4等。在反相柱中C18（Octadecylsilyl，簡(jiǎn)稱ODS），即十八烷基硅烷鍵合硅膠填料，這種填料在反相色譜中發(fā)揮著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜70～80％的分析任務(wù)。由于C18(ODS)是長(zhǎng)鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對(duì)各種類型的生物大分子有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此在生物化學(xué)分析工作中應(yīng)用的最為廣泛，近年來(lái)，為適應(yīng)氨基酸、小肽等生物分子的分析任務(wù)，又發(fā)展了CH、C3、C4等短鏈烷基鍵合相和大孔硅膠（20～40μm）。無(wú)水乙醇、抗壞血酸、氫氧化鉀、無(wú)水硫酸鈉乙醚、石油醚:沸程為30℃~60℃。pH試紙(pH范圍1~14)甲醇:色譜純。淀粉酶:活力單位≥100U/mg。2,6-二叔丁基對(duì)甲酚:簡(jiǎn)稱BHT。標(biāo)準(zhǔn)品維生素A標(biāo)準(zhǔn)品、維生素E標(biāo)準(zhǔn)品試劑作用？步驟：樣品皂化提取濃縮色譜分析18目的、步驟方法方法、設(shè)備條件試樣制備

將一定數(shù)量的樣品按要求經(jīng)過縮分、粉碎均質(zhì)后,儲(chǔ)存于樣品瓶中,避光冷藏,盡快測(cè)定。注意：使用的所有器皿不得含有氧化性物質(zhì);分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油;處理過程應(yīng)避免紫外光照,盡可能避光操作;提取過程應(yīng)在通風(fēng)柜中操作。皂化1不含淀粉樣品稱取試樣于150mL平底燒瓶中,再加入1.0g抗壞血酸和0.1gBHT,混勻,加入30mL無(wú)水乙醇,加入10mL~20mL氫氧化鉀溶液,邊加邊振搖,混勻后于80℃恒溫水浴震蕩皂化30min,皂化后立即用冷水冷卻至室溫。2含淀粉樣品稱取樣品于150mL平底燒瓶中,加入0.5g~1g淀粉酶,放入60℃水浴避光恒溫振蕩30min后,取出,向酶解液中加入1.0g抗壞血酸和0.1gBHT,混勻,加入30mL無(wú)水乙醇,10mL~20mL氫氧化鉀溶液,邊加邊振搖,混勻后于80℃恒溫水浴振蕩皂化30min,皂化后立即用冷水冷卻至室溫。提取

將皂化液用30mL水轉(zhuǎn)入250mL的分液漏斗中,加入50mL石油醚-乙醚混合液,振蕩萃取5min,將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一250mL的分液漏斗中,加入50mL的混合醚液再次萃取,合并醚層。注:如只測(cè)維生素A與α-生育酚,可用石油醚作提取劑。

用約100mL水洗滌醚層,約需重復(fù)3次,直至將醚層洗至中性(可用pH試紙檢測(cè)下層溶液pH值),去除下層水相。濃縮將洗滌后的醚層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉(約3g)濾入250mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶或氮?dú)鉂饪s管中,用約15mL石油醚沖洗分液漏斗及無(wú)水硫酸鈉2次,并入蒸發(fā)瓶?jī)?nèi),并將其接在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀或氣體濃縮儀上,于40℃水浴中減壓蒸餾或氣流濃縮,待瓶中醚液剩下約2mL時(shí),取下蒸發(fā)瓶,立即用氮?dú)獯抵两?。用甲醇分次將蒸發(fā)瓶中殘留物溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中,定容至刻度。溶液過0.22μm有機(jī)系濾膜后供高效液相色譜測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作本法采用外標(biāo)法定量。將維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液分別注入高效液相色譜儀中,測(cè)定相應(yīng)的峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算直線回歸方程。

樣品測(cè)定

試樣液經(jīng)高效液相色譜儀分析,測(cè)得峰面積,采用外標(biāo)法通過上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。在測(cè)定過程中,建議每測(cè)定10個(gè)樣品用同一份標(biāo)準(zhǔn)溶液或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢查儀器的穩(wěn)定性。

二、比色法測(cè)定VA的含量（一）原理在氯仿溶液中，VA與三氯化銻可生成藍(lán)色可溶性絡(luò)合物，在620nm

波長(zhǎng)處有最大吸收峰，其吸光度與VA的含量在一定的范圍內(nèi)成正比，故可比色測(cè)定。24（二）適用范圍及特點(diǎn)本法適用于維生素A含量較高的各種樣品(高于5—10μg／g)，對(duì)低含量樣品，因受其他脂溶性物質(zhì)的干擾．不易比色測(cè)定;該法的主要缺點(diǎn)是生成的藍(lán)色絡(luò)合物的穩(wěn)定性差。比色測(cè)定必須在，否則藍(lán)色會(huì)迅速消退，將造成極大誤差。

6秒鐘內(nèi)完成25（三）分析步驟（1）試樣處理根據(jù)試樣性質(zhì)，可采用皂化法或研磨法。1）皂化法適用于維生素A含量不高的試樣，可減少脂溶性物質(zhì)的干擾，但全部試驗(yàn)過程費(fèi)時(shí)，且易導(dǎo)致維生素A損失。皂化提取洗滌濃縮

26a皂化:根據(jù)試樣中維生素A含量的不同，準(zhǔn)確稱取0.5-5g試樣于三角瓶中，加入10mL氫氧化鉀(1+1)及20mL-40mL乙醇，于電熱板上回流30min，至皂化完全為止。b提取:將皂化瓶?jī)?nèi)混合物移至分液漏斗中，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗(如有渣子，可用有脫脂棉的漏斗濾入分液漏斗內(nèi)）。用50mL乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振搖并注意放氣，靜置分層后，水層放入第二個(gè)分液漏斗內(nèi)。皂化瓶再用約30mL乙醚分二次沖洗，洗液傾入第二個(gè)分液漏斗中。振搖后，靜置分層，水層放入三角瓶中，醚層與第一個(gè)分液漏斗合并。重復(fù)至水液中無(wú)維生素A為止。27c洗滌:用約30mL水加入第一個(gè)分液漏斗中，輕輕振搖，靜置片刻后，放去水層。加15mL-20mL0.5mol/L氫氧化鉀溶液于分液漏斗中，輕輕振搖后，棄去下層堿液，除去醚溶性酸皂。繼續(xù)用水洗滌，每次用水約30mL，直至洗滌液與酚酞指示劑呈無(wú)色為止（大約3次)。醚層液靜置10min-20min，小心放出析出的水層。d濃縮:將醚層液經(jīng)過無(wú)水硫酸鈉濾入三角瓶中，再用約25mL乙醚沖洗分液漏斗和硫酸鈉兩次，洗液并入三角瓶?jī)?nèi)。置水浴上蒸餾，回收乙醚。待瓶中剩約5mL乙醚時(shí)取下，用減壓抽氣法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中維生素A含量在適宜濃度范圍內(nèi)。282）研磨法適用于每克試樣維生素A含量大于5ug-10ug試樣的測(cè)定，如肝的分析步驟簡(jiǎn)單，省時(shí)，結(jié)果準(zhǔn)確。研磨提取濃縮

a、研磨:精確稱2g-5g試樣，放入盛有3倍-5倍試樣質(zhì)量的無(wú)水硫酸鈉研缽中，研磨至試樣中水分完全被吸收，并均質(zhì)化。29b、提取:小心將全部均質(zhì)化試樣移入帶蓋的三角瓶?jī)?nèi)，準(zhǔn)確加入50mL-100mL乙醚。緊壓蓋子，用力振搖2min，使試樣中維生素A溶于乙醚中。使其自行澄清(大約需1h-2h)，或離心澄清(因乙醚易揮發(fā)，氣溫高時(shí)應(yīng)在冷水浴中操作。裝乙醚的試劑瓶也應(yīng)事先放入冷水浴中)。c、濃縮:取澄清的乙醚提取液2mL-5mL，放入比色管中，在70℃--80℃水浴上抽氣蒸干，立即加入1mL三氯甲烷溶解殘?jiān)?0（2）測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備準(zhǔn)確取一定量的維生素A標(biāo)準(zhǔn)液于4-5個(gè)容量瓶中，以三氯甲烷配制標(biāo)準(zhǔn)系列。再取相同數(shù)量比色管順次取1mL三氯甲烷和標(biāo)準(zhǔn)系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成標(biāo)準(zhǔn)比色系列。于620nm波長(zhǎng)處，以三氯甲烷調(diào)節(jié)吸光度至零點(diǎn)，將其他標(biāo)準(zhǔn)比色系列按順序移入光路前，迅速加入9mL三氯化銻一三氯甲烷溶液。于6s內(nèi)測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，維生素A含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。31試樣測(cè)定

于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入1滴乙酸酐為空白液。另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其余比色管中分別加入1mL試樣溶液及1滴乙酸酐。其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。32結(jié)果計(jì)算：X試樣中維生素A的含量，mg/100gc—由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得試樣中維生素的含量，μg/mLm—試樣質(zhì)量，gV—提取后加三氯甲烷定量之體積，mL計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字33注意事項(xiàng)：①維生素A極易被光破壞，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在微弱光線下進(jìn)行，或使用棕色玻璃儀器。②乙醚為溶劑的萃取體系，易發(fā)生乳化現(xiàn)象。在提取、洗滌操作中，不要用力過猛，若發(fā)生乳化，可加幾滴乙醇破乳。③所用氯仿中不應(yīng)含有水分，因三氯化銻遇水會(huì)出現(xiàn)沉淀，干擾比色測(cè)定。故在每毫升氯仿中應(yīng)加入乙酸酐1滴，以保證脫水。另外，由于三氯化銻遇水生成白色沉淀，因此用過的儀器要用稀鹽酸浸泡后再清洗。34④由于三氯化銻與維生素A所產(chǎn)生的藍(lán)色物質(zhì)很不穩(wěn)定，通常生成6S后便開始比色，因此要求反應(yīng)在比色管中進(jìn)行，產(chǎn)生藍(lán)色后立即讀取吸光度。⑤如果樣品中含β-胡蘿卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干擾測(cè)定，可將濃縮蒸干的樣品用正己烷溶解，以氧化鋁為吸附劑，丙酮、乙烷混合液為洗脫劑進(jìn)行柱層析。⑥比色法除用三氯化銻做顯色劑外，還可用三氟乙酸、三氯乙酸做顯色劑。其中三氟乙酸沒有遇水發(fā)生沉淀而使溶液混濁的缺點(diǎn)。35

三、維生素D的測(cè)定

維生素D是指含有抗佝僂病活性的一類物質(zhì)，具有維生素D活性的化合物約有l(wèi)0種，其中最重要的是維生素D2、維生素D3及其維生素D原。維生素D2無(wú)天然存在，維生素D2只存在于某些動(dòng)物性食物中。但它們都可由維生素D原(麥角固醇和7一脫氫膽固醇)經(jīng)紫外線照射形成。維生素D2

藥片吃多了中毒。36

分析方法中較好的是比色法和高效液相色譜法。

(一)三氯化銻比色法原理：在三氯甲烷溶液中，維生素D與三氯化銻結(jié)合生成一種橙黃色化合物，呈色強(qiáng)度與維生素D的含量成正比。樣品處理：同維生素A的測(cè)定。食品中維生素D的含量一般很低，而維生素A、維生素E、膽固醇、速甾醇等成分的含量往往大都超過維生素D，嚴(yán)重干擾維生素D的測(cè)定，因此測(cè)定前必須經(jīng)柱層析除去這些干擾成分。37

(二)液相色譜法它的的靈敏度較比色法高30倍以上，且操作簡(jiǎn)便，精度高，分析速度快。是目前分析維生素D的最好方法。原理試樣在焦性沒食子酸的保護(hù)下皂化，以石油醚萃取后，用正相色譜柱提取富集，用反相色譜柱進(jìn)一步分離，紫外檢測(cè)器定量測(cè)定。38

1、本法使用兩級(jí)HPLC，正相色譜柱用于維生素D的提取富集，反相型柱用于把維生素D與許多其他干擾物質(zhì)分離。2、本法對(duì)維生素D2、維生素D3不加區(qū)分，兩者混合存在時(shí)，以總維生素D定量。3、維生素D的含量表示可用mg/100g，也可用國(guó)際單位（IU），1IU相當(dāng)于0.025ug維生素D。39作業(yè)題測(cè)定脂溶性維生素時(shí)樣品需如何處理？40

第三節(jié)水溶性維生素的測(cè)定

水溶性維生素，廣泛存在于動(dòng)植物組織中，飲食來(lái)源充足。但是由于它們本身的水溶性質(zhì)，除滿足人體生理、生化作用外，任何多余量都能從機(jī)體排出。為避免耗盡，需要經(jīng)常地由飲食來(lái)提供。411.水溶性維生素的理化性質(zhì)

①水溶性維生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機(jī)溶劑。②在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定，既使加熱也不破壞；③但在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解，特別在堿性條件下加熱，可大部分或全部破壞。④它們易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響。維生素B2對(duì)光，特別是紫外線敏感，易被光線破壞；維生素C對(duì)氧、銅離子敏感，易被氧化。422.前處理

根據(jù)上述性質(zhì)，測(cè)定水溶性維生素時(shí)，一般都在酸性溶液中進(jìn)行前處理。

維生素Bl、B2

鹽酸水解酶解

提取純化維生素C通常采用草酸、草酸—醋酸、偏磷酸—醋酸溶液直接提取。在一定濃度的酸性介質(zhì)中，可以消除某些還原性雜質(zhì)對(duì)維生素C的破壞作用。草酸價(jià)廉，使用方便，對(duì)維生素C有很好的穩(wěn)定作用。淀粉酶、木瓜蛋白酶活性人造浮石、硅鎂吸附劑43一、維生素Bl的測(cè)定

維生素Bl又名硫胺素、抗神經(jīng)炎素，通常以游離態(tài)，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麥胚、花生、黃豆以及綠色蔬菜和牛乳、蛋黃中含量較為豐富。分析方法：GB/T5009.84—2016441.原理

硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中被氧化成硫色素（吡哆色素），在紫外光照射下，硫色素發(fā)出藍(lán)色熒光，在給定的條件下以及沒有其他熒光物質(zhì)干擾時(shí)，其熒光值與硫色素的含量成正比，即與溶液中硫胺素含量成正比。452.分析步驟（1）試樣處理樣品采集后將樣品盡量處理均勻，于低溫冰箱中冷凍保存，用時(shí)將其解凍后使用。（2）提取：A、精確稱取一定量試樣，置于錐形瓶中，加入0.1或0.3mol/L鹽酸使其溶解，瓶口加蓋小燒杯后放入高壓鍋中加熱水解30min（硫胺素由結(jié)合態(tài)變?yōu)橛坞x態(tài)），涼后取出。B、用2mol/L乙酸鈉調(diào)其pH為4.5（溴甲酚綠為外指示劑）。C、按每克試樣加入20mg淀粉酶的比例加入淀粉酶。于45-50℃保溫16h。D、冷卻至室溫，定容至100mL，混勻過濾，即為提取液46（3）凈化：A、用少許脫脂棉鋪于鹽基交換管的交換柱底部，加水將棉纖維中氣泡排出；再裝入活性人造浮石，保持鹽基交換管中液面始終高于活性人造浮石，防止浮石氧化，失去活性B、用移液管加入提取液20-80mL。C、加入約10mL熱水沖洗交換柱，棄取洗液。重復(fù)3次。D、加入90℃、250g/L的酸性氯化鉀20mL，收集入25mL刻度試管中，冷卻至室溫，用酸性氯化鉀定容至25mL，即為試樣凈化液。E、將20mL硫胺素標(biāo)準(zhǔn)使用液加入鹽基交換管代替樣品提取液，重復(fù)A-D，即得到標(biāo)準(zhǔn)凈化液。47（4）氧化：A、將5mL試樣凈化液分別加入A、B兩個(gè)Maizel-Gerson反應(yīng)瓶。B、在避光暗處將3mL150g/L氫氧化鈉加入反應(yīng)瓶A中，振搖約15s，然后加入10mL正丁醇；將3mL堿性鐵氰化鉀溶液加入反應(yīng)瓶B中，振搖約15s，然后加入10mL正丁醇；將A，B兩個(gè)反應(yīng)瓶同時(shí)用力振搖，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)1.5min。C、用標(biāo)準(zhǔn)凈化液代替試樣凈化液，重復(fù)A，B。D、用黑布遮蓋A，B反應(yīng)瓶，靜置分層后棄取下層堿性溶液，加入2-3g無(wú)水硫酸鈉使溶液脫水。48（5）熒光強(qiáng)度的測(cè)定A、測(cè)定條件：激光波長(zhǎng)365nm；發(fā)射波長(zhǎng)435nm；激發(fā)波狹縫5nm；發(fā)射波狹縫5nm。B、依次測(cè)定試樣空白熒光強(qiáng)度、標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強(qiáng)度、試樣熒光強(qiáng)度、標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度。3.計(jì)算494.說明：

（1）食品中的維生素B1有游離型的，也有結(jié)合型的，即與蛋白質(zhì)、淀粉等結(jié)合在一起，故需用酸和酶水解，使結(jié)合型成為游離型。（2）可在加入酸性氯化鉀以后停止實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榱虬匪卦诖巳芤褐斜容^穩(wěn)定。（3）加入的鐵氰化鉀量要充足，但也不能過量，否則會(huì)將硫色素氧化。樣品與鐵氰化鉀溶液混合后，所呈現(xiàn)的黃色應(yīng)至少保持15秒，否則應(yīng)再滴加鐵氰化鉀溶液1-2滴。因?yàn)闃悠分腥绾羞€原性物質(zhì)，而鐵氰化鉀用量不夠時(shí)，硫胺素氧化不完全，給結(jié)果帶來(lái)誤差。但過多的鐵氰化鉀會(huì)破壞硫色素，故其用量應(yīng)恰當(dāng)控制。50（4）硫色素能溶于正丁醇（微溶于水），在正丁醇中比在水中穩(wěn)定，故用正丁醇提取硫色素。萃取時(shí)振搖不宜過猛，以免乳化，不宜分層。（5）硫色素在紫外線照射下會(huì)被破壞，所以硫胺素氧化后，反應(yīng)瓶要用黑布遮蓋或在暗室中進(jìn)行反應(yīng)和熒光測(cè)定。（6）用甘油-淀粉潤(rùn)滑劑代替凡士林涂鹽基交換管下活塞，因凡士林具有熒光。（7）谷類物質(zhì)不需酶分解，樣品粉碎后直接用25%酸性氯化鉀直接提取，氧化測(cè)定。（8）氧化是操作的關(guān)鍵步驟，操作中應(yīng)保持加試劑的迅速一致。51二、維生素B2的測(cè)定

維生素B2即核黃素。在食品中以游離形式或磷酸酯等結(jié)合形式存在。膳食中的主要來(lái)源是各種動(dòng)物性食品，其中以肝、腎、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆類和新鮮綠葉蔬菜。分析方法：GB/T5009.85—2016中第一法為高效液相色譜法。第二法為熒光法。52一、理化性質(zhì)：

1、能溶于水，水溶液呈現(xiàn)強(qiáng)的黃綠色熒光；2、對(duì)空氣、熱穩(wěn)定；3、在中性和酸性溶液中即使短時(shí)間高壓加熱也不至于破壞，在堿性溶液中則較易被破壞；4、游離核黃素對(duì)光敏感，特別是紫外線，可產(chǎn)生不可逆分解。53熒光法

原理：維生素B2（即核黃素）在440-500nm紫外光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，在一定濃度范圍內(nèi)其熒光強(qiáng)度與核黃素濃度成正比。用連二亞硫酸鈉還原核黃素成無(wú)熒光物質(zhì)，由還原前后熒光強(qiáng)度之差與內(nèi)標(biāo)熒光強(qiáng)度的比值，計(jì)算樣品中核黃素的含量。54

注意：1、測(cè)定中，需用高錳酸鉀氧化去雜質(zhì)，用硅鎂吸附劑吸附分離；2、核黃素對(duì)光敏感，整個(gè)操作應(yīng)在暗室中進(jìn)行；3、核黃素可被低亞硫酸鈉還原成無(wú)熒光型，但搖動(dòng)后很快就被空氣氧化成有熒光物質(zhì)，所以要立即測(cè)定。55三、維生素C的測(cè)定

維生素C是一種己糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以又稱作抗壞血酸。維生素C廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑桔等食品中含量尤豐富。

維生素C具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性。進(jìn)一步水解則生成2，3-二酮古樂糖酸，失去生理作用。測(cè)定維生素C常用的方法有：靛酚滴定法、苯肼比色法、熒光法和高效液相色譜法等。GB5009.86—2016食品中抗壞血酸的測(cè)定第一法為高效液相色譜法。第二法為熒光法。第三法為2，6—二氯靛酚滴定法56(一)2，6—二氯靛酚滴定法

1．原理還原型抗壞血酸可以還原染料2，6-二氯靛酚。該染料在酸性溶液中呈粉紅色(在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色)，被還原后顏色消失。還原型抗壞血酸還原染料后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時(shí)，一定量的樣品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)染料液的量，與樣品中抗杯血酸含量成正比。57試劑偏磷酸(HPO3)n

草酸碳酸氫鈉(NaHCO3)。2,6-二氯靛酚(2,6-二氯靛酚鈉鹽,C12H6Cl2NNaO2)。白陶土(或高嶺土):對(duì)抗壞血酸無(wú)吸附性。2,6-二氯靛酚標(biāo)定方法標(biāo)定方法:準(zhǔn)確吸取1mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL錐形瓶中,加入10mL偏磷酸溶液或草酸溶液,搖勻,用2,6-二氯靛酚溶液滴定至粉紅色,保持15s不褪色為止。同時(shí)另取10mL偏磷酸溶液或草酸溶液做空白試驗(yàn)。抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)品L(+)-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品(C6H8O6):純度≥99。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制L(+)-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.000mg/mL):稱取100mg(精確至0.1mg)L(+)-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品,溶于偏磷酸溶液或草酸溶液并定容至100mL。該貯備液在2℃~8℃避光條件下可保存一周。測(cè)定整個(gè)檢測(cè)過程應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。試液制備:稱取具有代表性樣品的可食部分100g,放入粉碎機(jī)中,加入100g偏磷酸溶液或草酸溶液迅速搗成勻漿。準(zhǔn)確稱取10g~40g勻漿樣品(精確至0.01g)于燒杯中,用偏磷酸溶液或草酸溶液將樣品轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶,并稀釋至刻度,搖勻后過濾。若濾液有顏色,可按每克樣品加0.4g白陶土脫色后再過濾。滴定準(zhǔn)確吸取10mL濾液于50mL錐形瓶中,用標(biāo)定過的2,6-二氯靛酚溶液滴定,直至溶液呈粉紅色15s不褪色為止。同時(shí)做空白試驗(yàn)。結(jié)果計(jì)算試樣中L(+)-抗壞血酸含量按下式計(jì)算:X=(V-V0)×T×A×100 式中:X———試樣中L(+)-抗壞血酸含量,單位為毫克每百克(mg/100g);V———滴定試樣所消耗2,6-二氯靛酚溶液的體積,單位為毫升(mL);V0———滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的體積,單位為毫升(mL);T———2,6-二氯靛酚溶液的滴定度,即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相當(dāng)于抗壞血酸的毫克數(shù)(mg/mL);m———試樣質(zhì)量,單位為克(g)。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留三位有效數(shù)字。(二)熒光法

樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化生成脫氫型抗壞血酸后，與鄰苯二胺反應(yīng)，生成具有熒光的喹喔啉，其熒光強(qiáng)度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測(cè)定食品中抗壞血酸和還原型抗壞血酸的總量。64(三)2，4—二硝基苯肼比色法1、原理

先將樣品中的還原型抗