srepomycesmicroflavus5發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

srepomycesmicroflavus5發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1材料和方法1.1病毒streptic微藻組2005已從河北省中國科學(xué)院微生物研究所分離并保存。1.2培養(yǎng)基的制備1:蛋白胨0.5%,葡萄糖1%,氯化鈉0.5%,pH7.2～7.4。121℃滅菌30min。2:蔗糖1.5%,可溶性淀粉5%,豆餅粉1.7%,K2HPO4·3H2O0.4%,酵母膏0.3%,(NH4)2SO40.2%,CaCO30.2%,NaCl0.2%,pH7.2～7.4。豆餅粉沸水煮1h后,用8層紗布過濾,蒸餾水洗濾渣2次,棄去濾渣,合并濾液用于培養(yǎng)基配制。121℃滅菌30min。3:玉米粉2.0%,可溶性淀粉2.0%,蔗糖2.0%,豆餅粉1.5%,酵母粉0.1%,(NH4)2SO40.25%,MgSO40.0025%,K2HPO40.02%,NaCl0.5%,CaCO30.5%,pH7.2～7.4。豆餅粉需沸水煮1h后,用8層紗布過濾,蒸餾水洗濾渣2次,棄去濾渣,合并濾液用于培養(yǎng)基配制。121℃滅菌30min。4:可溶性淀粉4.5%,蔗糖2.5%,豆餅粉3.0%,NaNO30.8%,ZnSO40.01%,KH2PO40.001%,pH7.0。豆餅粉需沸水煮1h后,用8層紗布過濾,蒸餾水洗濾渣2次,棄去濾渣,合并濾液用于培養(yǎng)基配制。121℃滅菌30min。5:可溶性淀粉2%,KNO30.1%,K2HPO40.05%,MgSO40.05%,FeSO40.001%,NaCl0.05%,pH7.2～7.4。121℃滅菌30min。1.3液體種子培養(yǎng)將用高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)好的斜面菌種接種一環(huán)到裝有100mL高氏1號液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,28℃振蕩培養(yǎng)24h,轉(zhuǎn)速210r/min。種子培養(yǎng)完畢后,將液體種子按7%接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基(1000mL三角瓶裝培養(yǎng)基200mL),28℃振蕩培養(yǎng)120h,轉(zhuǎn)速210r/min進行發(fā)酵培養(yǎng)。8000r/min離心10min收集菌體,蒸餾水洗滌3次,105℃烘干至恒重,稱量菌體干重。1.4菌液用量及培養(yǎng)時間在大試管內(nèi)裝入等量蛭石,每管加入培養(yǎng)液40mL。每管加玉米“農(nóng)大108”種子2粒,按每公頃施用0、1500、3000、4500、6000mLStreptomycesmicroflavus005菌液計算每管用量,拌種,每個處理重復(fù)4次。定時補充培養(yǎng)液,每天輪換試管位置,相同條件下培養(yǎng)21d。觀察出苗率和出苗時間,測量株高、葉面積、地上部分干重和根重。1.5不同施肥方案試驗在河北省微生物研究所院內(nèi)實驗田進行,土質(zhì)為砂壤土,肥力中上。采用隨機區(qū)組排列,4次重復(fù),每小區(qū)長10m,寬2m,面積20m2。玉米品種為“農(nóng)大108”。試驗設(shè)4個處理,處理1為對照,采用常規(guī)施肥,每公頃施尿素250kg;處理2為每公頃菌液1500mL+常規(guī)施肥;處理3為每公頃施菌液3000mL+常規(guī)施肥;處理4為每公頃施菌液6000mL+常規(guī)施肥。尿素基施,菌液稀釋后拌種。小區(qū)內(nèi)分4行,每行30穴,每穴播種2～3粒。3葉期進行間苗,去除弱苗、病苗,缺株的要及時補苗,5葉期定苗,每穴留單株。拔節(jié)期和大喇叭口期分別追施尿素200kg/hm2。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)基成分對菌體產(chǎn)量的影響分別用5種基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)Streptomycesmicroflavus005,發(fā)酵結(jié)束離心收集菌體并干燥稱重。不同培養(yǎng)基得到的生物量干重分別為:1號培養(yǎng)基1.40g/L;2號培養(yǎng)基15.12g/L;3號培養(yǎng)基8.71g/L;4號培養(yǎng)基17.67g/L;5號培養(yǎng)基1.66g/L。結(jié)果表明4號培養(yǎng)基菌體產(chǎn)量最高,2號培養(yǎng)基次之,1號培養(yǎng)基菌體量最低。比較幾種培養(yǎng)基組成證明C、N源較豐富的培養(yǎng)基能獲得更多的菌體量。所以以4號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)設(shè)計L9(34)正交試驗,考察不同含量的可溶性淀粉、蔗糖、豆餅粉和NaNO3對菌體產(chǎn)量的影響,每個處理設(shè)2次重復(fù),試驗方案見表1。對實驗結(jié)果進行極差分析,試驗結(jié)果和數(shù)理統(tǒng)計結(jié)果見表2。由表2可見,極差R蔗糖>豆餅粉>可溶性淀粉>NaNO3。蔗糖含量對菌絲產(chǎn)量影響最大,過高的蔗糖含量并不利于菌體生長。豆餅粉含量對菌絲產(chǎn)量也有較高影響,豆餅粉含量的增加有利于菌體生長?？扇苄缘矸酆繉w產(chǎn)量的影響小于蔗糖和豆餅粉的影響,適當?shù)牡矸酆孔钣欣诰w生長。NaNO3含量對菌體產(chǎn)量影響較低,為了降低成本可以選擇一個較低的含量。適當?shù)腃源和N源含量最有利于菌體生長,因此優(yōu)化后的培養(yǎng)基為:可溶性淀粉4.5%,蔗糖0.5%,豆餅粉4.5%,NaNO30.2%,ZnSO40.01%,KH2PO40.001%。2.2蘋果果粒的制備在1000mL三角瓶內(nèi)分別裝入100、150、250、350mL培養(yǎng)基,接種量7%,28℃,210r/min振蕩培養(yǎng)120h,結(jié)果見圖1。試驗結(jié)果證明當裝液量為150mL/L時,能夠得到最高的菌體產(chǎn)量,菌體產(chǎn)量達到48.3g/L。裝液量350mL/L時菌體產(chǎn)量最低,但干重也達到23.3g/L,比培養(yǎng)基優(yōu)化前的17.67g/L也有很大提高。當裝液量為100mL/L時,菌體雖然生長迅速,但自溶時間提前,從而造成最終菌絲產(chǎn)量有所下降。證明Streptomycesmicroflavus005為好氧菌,適當提高通氣量有利于菌體生長。2.3菌劑對出苗的影響分別按每公頃施用1500、3000、4500、6000mL發(fā)酵液計算使用量,以不施菌劑做對照,培養(yǎng)21d,觀察出苗時間、出苗率、測量株高、地上部分干重、根重。對照和使用不同劑量菌液處理的出苗率均為100%,使用菌液的處理比對照出苗時間整體早1～2d。株高、地上部分干重、根重試驗結(jié)果見表3。用最小顯著差數(shù)法(LSD法)對試驗結(jié)果進行分析。結(jié)果表明,不同用量菌劑的處理與對照比平均株高增加了9.8%～12.6%,都達到極顯著差異水平。對葉面積也有促進作用,比對照增加了6.2%～15.6%,但未達到顯著差異水平。地上部分干重有不同程度的增加,處理1和處理4與對照比達到極顯著差異水平。菌劑促進了玉米苗期根系的發(fā)育,根重均有不同程度增加,但與對照比未達到顯著差異水平。從統(tǒng)計結(jié)果看,菌劑對地上部分的促生效果要好于對根的促生效果。從實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)使用Streptomycesmicroflavus005菌液后能明顯促進玉米苗期生長。2.4不同用量對玉米生長的影響不同處理的小區(qū)玉米成熟收獲后分別測量禿尖、千粒重并計算單產(chǎn),結(jié)果見表4。用最小顯著差數(shù)法(LSD法)對試驗結(jié)果進行分析。小區(qū)試驗表明施用不同用量S.microflavus005菌液后均能促進玉米生長。禿尖長度均比對照短,與對照比差異均達到極顯著水平。千粒重比對照均有所增加,其中3000mL/hm2處理與對照比達到顯著差異水平,6000mL/hm2處理達到極顯著差異水平。單產(chǎn)分別比對照增加6.9%,11.1%和15.3%,與對照比都達到極顯著差異水平,其中最高單產(chǎn)達8300kg/hm2。3發(fā)酵條件的確定通過正交試驗初步確定了S.microflavus005的發(fā)酵培養(yǎng)基,結(jié)果表明C和N源對菌體生長有較大影響。不同裝液量實驗結(jié)果表明該菌生長所需通氣量較大,適當加大通氣量能提高菌體產(chǎn)量。按優(yōu)化后的培養(yǎng)條件菌體產(chǎn)量接近初始條件菌體產(chǎn)量的3倍。玉米的水培和小區(qū)實驗表明S.microflavus005發(fā)酵液對玉米有促生作用:苗期促進種子發(fā)芽、根系發(fā)達,植株粗壯;后期促進干物質(zhì)積累,千粒重增加,單產(chǎn)最高比對照增加15.3%。試驗證明液體培養(yǎng)S.microflavus005與固體培養(yǎng)5406抗生菌肥具有相似的肥效,施用量更低。液體發(fā)酵與原來的土法固體培養(yǎng)相比勞動強度更低,更易于控制菌劑質(zhì)量以便于工業(yè)化大生產(chǎn)。研究表明細黃鏈霉菌能夠分泌促生激素并促進作物對氮磷的吸收利用,進而提高產(chǎn)量,對于S.microflavus005菌株的深入促生機理還有待進一步研究。生物肥料是指以微生物生命活動導(dǎo)致農(nóng)作物得到特定肥料效應(yīng)的制品,國際上對廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的菌肥稱為生物肥料(Biofertilizer),我國稱之為微生物肥料(Microbialfertilizer)。目前,微生物肥料按其制品中特定的微生物種類可分為細菌肥料(如根瘤菌肥)、放線菌肥料(如5406)、真菌類肥料(如菌根真菌)等;以微生物肥料的作用機理可劃分為固氮菌類肥料、解磷菌類肥料、解鉀菌類肥料、外生菌根菌肥料等。我國自20世紀50年代開始使用放線菌5406,該菌株經(jīng)鑒定為細黃鏈霉菌乳糖變種。在小麥、蔬菜、煙草、人參等多種大田和經(jīng)濟作物上的使用結(jié)果表明能夠促進作物生長,提高產(chǎn)量并具有一定抗病、驅(qū)蟲作用。研究表明放線菌5406能夠產(chǎn)生生長刺激素和抗菌素,轉(zhuǎn)化土壤中的氮素和磷素物質(zhì)提高土壤肥力進而有促進作物生長的作用。5406的生產(chǎn)傳統(tǒng)工