誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)發(fā)展綜述

誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)發(fā)展綜述【摘要】多能干細胞是當(dāng)前干細胞研究的熱點和焦點。它可以分化成體內(nèi)所有的細胞，進而形成身體的所有組織和器官。因此，誘導(dǎo)多能干細胞的研究不僅具有重要的理論意義，而且在器官再生、修復(fù)和疾病治療方面極具應(yīng)用價值。本文整理了近些年來誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)的發(fā)展歷程及應(yīng)用，介紹了誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)的現(xiàn)況?！娟P(guān)鍵詞】誘導(dǎo)多能干細胞；iPScells1、誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)發(fā)展簡介細胞重編程指成熟體細胞在特定條件下逆分化后恢復(fù)全能性狀態(tài)，形成具有再分化潛能的干細胞系，或者進一步發(fā)育成一個新個體的過程1。通過不懈的探索，重編程技術(shù)已經(jīng)由成熟體細胞核與去核卵母細胞的融合發(fā)展到轉(zhuǎn)化因子直接對細胞核的重編程。這種經(jīng)轉(zhuǎn)化因子重編程而獲得的多分化潛能的干細胞被稱為誘導(dǎo)多功能干細胞(inducedpluripotentstemcells，iPScells)。1962年，Gurdon將非洲爪蟾的腸上皮細胞核注入去核的卵母細胞中進行培養(yǎng)，成功培育出可以發(fā)育為成熟爪蟾的胚胎4。Gurdon實現(xiàn)了終末分化期細胞核的重編程，成為證明細胞核全能性的關(guān)鍵證據(jù)，使細胞分化是通過對基因可逆性修飾而實現(xiàn)的觀點得到了普遍接受。誘導(dǎo)多能干細胞成功最早是2006年由日本的兩位科學(xué)家KazutoshiTakahashi和ShinyaYamanaka3報道，他們對24個符合此類條件的候選基因進行篩選，將這些基因?qū)胧篌w細胞中(采用逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染的方式)誘導(dǎo)體細胞成為多能干細胞。兩位科學(xué)家巧妙地采用24-1的篩選方式，以確定那些基因?qū)τ贗PS用處不大。而后進一步采用10-1的篩選方式，最終確定Oct3/4,Sox2,c-MycKlf4這四個轉(zhuǎn)錄因子可以在體外直接誘導(dǎo)小鼠的皮膚成纖維體細胞成為具有像胚胎干細胞一樣有多發(fā)于潛能的多能性肝細胞。這四個因子最終也被很多學(xué)者稱為“典型山中因子”。小鼠iPSC的成功誘導(dǎo)為人類細胞重編程帶來了新的希望。2007年Yamanaka研究團隊再一次證明運用逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入相同的人類轉(zhuǎn)錄因子組合，即Oct3/4、Klf4、Sox2和e-Mye能夠?qū)崿F(xiàn)HDF的重編程。實驗證明，人類iPSC與ESC的相似性體現(xiàn)在形態(tài)、增殖周期、培養(yǎng)條件、表面標(biāo)志物、基因表達、啟動子活性和端粒酶活性等很多方面。同時，實驗證明人類iPSC可以被直接引導(dǎo)再分化形成神經(jīng)細胞和心肌細胞1。同年美國Whitehead研究所Jaenisch博士研究組重復(fù)并改進了Yamanaka的iPS工作，他們建立的小鼠可以無限擴增，和分化為體內(nèi)任何細胞5。之后，Jaenisch博士利用基因打靶修正基因，將含有正確基因的iPS誘導(dǎo)分化為血液干細胞移植到患有鐮刀貧血的小鼠體內(nèi)，使之癥狀得以改善6。這一過程證明iPScells有疾病治療的潛能。2009年7月，中國科學(xué)院動物研究所周琪和北京生命科學(xué)研究所高紹榮領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，分別利用iPS細胞克隆出小鼠，從而在世界上首次證明了iPS細胞的全能性20。先前國際上的相關(guān)研究始終未能成功，用iPS細胞培育的小鼠均胎死腹中?！蹲匀弧冯s志稱這一成果“為克隆成年哺乳動物開辟了一條全新道路”。盡管iPSC技術(shù)已初具雛形，但正如Yamanaka本人所強調(diào)，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)下的iPSC技術(shù)仍有很多缺陷，其中最主要的三個方面，即低效性、致癌性錯誤！未定義書簽。及免疫原性，這些缺陷極大地限制了iPSC在臨床與科研實踐中的應(yīng)用。近年來，iPSC技術(shù)得到了充分發(fā)展與改善，更多的轉(zhuǎn)化方式和更完善的培養(yǎng)技術(shù)使iPSC的誘導(dǎo)得到“質(zhì)”和“量”雙方面的提高。Yamanaka博士研究組嘗試用非病毒載體反復(fù)轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞7。美國麻省總醫(yī)院研究組應(yīng)用非整合型腺病毒導(dǎo)入4種因子建立iPScells8。美國Melton博士研究組僅用Oct-4和Sox2兩種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合小分子化合物成功誘導(dǎo)9。這些手段不同程度地提高了iPScells的安全性，但還是有外源基因?qū)搿?009年美國Scrippt研究所DingSheng博士研究組實現(xiàn)利用體外表達的4種轉(zhuǎn)錄因子的重組蛋白結(jié)合應(yīng)用組蛋白去乙酰酶抑制劑成功地建立小鼠iPS細胞系％這是首次通過非基因改造的方法實現(xiàn)體細胞重編程。隨后，美國科學(xué)家利用在哺乳類動物細胞表達的重組蛋白建立人的iPS細胞系。這些方法雖然避免了iPS細胞中導(dǎo)入外源基因系列，但是效率非常低。最近有報道利用改造的mRNA導(dǎo)入重編程因子，實現(xiàn)高效低建立iPScellsiio但有研究提示此法建立的iPScells含有蛋白編碼序列的突變，具體問題尚在研究中。2012年10月8日，Yamanaka與英國發(fā)育生物學(xué)家JohnGurdon因在細胞核重新編程研究領(lǐng)域的杰出貢獻而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。2、誘導(dǎo)多能十細胞技術(shù)的應(yīng)用iPS技術(shù)是干細胞研究乃至生命科學(xué)領(lǐng)域的一項重大突破，它回避了歷來已久的倫理爭議，解決了干細胞移植醫(yī)學(xué)上的免疫排斥問題，使干細胞向臨床應(yīng)用又邁進了一大步。隨著iPS技術(shù)的不斷發(fā)展以及技術(shù)水平的不斷更新，它在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的優(yōu)勢已日趨明顯，具體如下：⑴再生醫(yī)學(xué)運用病人自身體細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPScells發(fā)育而成的器官代替病變器官是再生醫(yī)學(xué)一直以來的終極目標(biāo)。已有文獻報道iPScells在帕金森病12、血小板缺陷癥13、脊髓損傷14和黃斑變性15等疾病中有了初步的探索和試驗。重編程的體細胞需要具備以下條件：易獲取、小風(fēng)險、數(shù)量足和易誘導(dǎo)，然而現(xiàn)有的iPScell技術(shù)尚未達到以上要求，對臨床治療風(fēng)險極大。根據(jù)Gorew等研究者的近期報道，外顯子測序顯示他們所調(diào)查的22株人類iPS細胞系中共有124個點突變，這些突變有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能受損及癌癥。盡管如此，通過iPScells技術(shù)實現(xiàn)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的臨床應(yīng)用依然具有著巨大吸引力和美好前景，更多的相關(guān)工作已經(jīng)開始逐步開展。⑵疾病模型的建立以GeorgeDaley17及KevinEggan18為代表，臨床疾病模型的建立近年來有了極大的發(fā)展。從2009年至2012年已有超過100份有關(guān)臨床病人特異性iPScells應(yīng)用的報道發(fā)表。iPScells技術(shù)可以培養(yǎng)出疾病及患者個性化的細胞系，相比動物疾病模型有著顯著優(yōu)勢。iPScells技術(shù)誘導(dǎo)下的疾病模型不僅有助于對疾病發(fā)生發(fā)展機制的分析理解，對新療法的發(fā)現(xiàn)也可以做出極大貢獻，例如iPScells誘導(dǎo)分化出的次代體細胞，尤其是心肌細胞及肝細胞，是理想的藥物毒性試驗對象，為臨床確定最佳治療方案可提供重要依據(jù)。⑶新藥物的研發(fā)隨著藥物研發(fā)領(lǐng)域的快速興起和工業(yè)化發(fā)展，體外驗藥系統(tǒng)在高通量篩選及早期無效分子剔除兩方面要求也不斷增高，一些大型制藥公司為此建立起ESC模型以滿足藥物檢測需要，遺憾的是由于ESC模型在倫理方面的限制，這種方法未曾得到廣泛應(yīng)用與推廣。iPS細胞系的應(yīng)用擺脫了倫理學(xué)限制并且建立起一個特異性更高的驗藥平臺，例如iPSC驗藥系統(tǒng)將使不同國家人種高度多樣化的代謝基因?qū)Ρ妊芯砍蔀榭赡?，從而掀起一場毒理學(xué)試驗領(lǐng)域的革命式改變19o總結(jié)半個多世紀(jì)以來，有關(guān)細胞命運的思考與探索從未停止，而今天研究者們在iPSC技術(shù)上所取得的巨大成就讓我們再一次見證了科學(xué)對生命本質(zhì)的成功解讀。隨著人們對細胞核重編程機制更加深入的了解，iPSC技術(shù)在科研及臨床實踐中的發(fā)展應(yīng)用潛力將得到愈加廣泛的認可，相信在不久的將來，高效、安全、規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化的新型iPSC技術(shù)會逐步發(fā)展走向成熟，并為人類的健康事業(yè)做出更大的貢獻。誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)研究和應(yīng)用將會成為21世紀(jì)最偉大的醫(yī)學(xué)生物學(xué)成就之一。引用TakahashiK,TanabeK,OhnukiM,etal.Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell,2007,131:861-872.BriggsR,KingTJ.Transplantationoflivingnucleifromblastulacellsintoenucleatedfrogseggs.ProcNatAcadSciUSA,1952,38:455-463.TakahashiK,YamanakaS.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell,2006,126:663-676.GurdonJB,eta1.Thetransplantationoflivingcellnuclei.AdvMorphog,1964,4:1-43.RudolfJaenisch.InvitroreprogrammingoffibroblastsintoapluripotentES-cell-likestate.Nature,448,318-324HannaJ,WernigM,MarkoulakiS,etal.TreatmentofsicklecellanemiamousemodelwithiPScellsgeneratedfromautologousskin.Science,2007,318(5858):1920-1923AoiT,YaeK,NakagawaM,etal.Generationofpluripotentstemcellsfromadultmouseliverandstomachcells,Science,2008,321(5889):699-702.StadtfeldM,NagayaM,UtikalJ,etal.I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