肺熱清解口服液與處方中總黃酮的抗菌效果比較

肺熱清解口服液與處方中總黃酮的抗菌效果比較

肺熱清解口服液是黃浦醫(yī)院根據(jù)醫(yī)院的處方和臨床醫(yī)療需要自行制備的復(fù)方中藥制劑。它由10種中藥組成：黑莓皮、蘆葦皮和弗洛伊木林皮。具有清熱、宣傳肺、止咳、哮喘的功效，主要用于肺熱咳嗽，主要用于急性支氣管炎和肺部感染的治療。桑白皮為該復(fù)方制劑中的君藥之一,主要化學(xué)成分有總黃酮類化合物、香豆素類化合物、多糖類化合物等,研究表明桑白皮的黃酮具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抑制蛋白糖基化等作用。除了桑白皮中含有總黃酮之外,該復(fù)方中君藥之一的蘆根也含有總黃酮類化合物。肺熱清解口服液用于治療肺熱咳嗽已經(jīng)獲得顯著的療效,為了將肺熱清解口服液更好地應(yīng)用于臨床,根據(jù)桑白皮、蘆根在處方中的地位及其總總黃酮作用的研究概況,對(duì)肺熱清解口服液和處方中的總黃酮抗菌、解熱實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究,這不僅可以為肺熱清解口服液的清熱宣肺、止咳平喘的功效提供科學(xué)依據(jù),還為肺熱清解口服液開(kāi)發(fā)成新藥奠定基礎(chǔ)。1設(shè)備和材料1.1實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備ZF-20D暗箱式紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠),400克搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司),4號(hào)(65目)藥篩(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司),YP3001N型電子天平(廣州儀通興儀器儀表有限公司),B-200型恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠),SHB-ш循環(huán)式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司),LDZX-50FAS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),SN-CT-1FD潔凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司),數(shù)碼顯示電熱培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),紅外電熱鼓風(fēng)干燥箱(重慶永生實(shí)驗(yàn)儀器廠)。1.2實(shí)驗(yàn)藥材鑒定蘆根、瓜蔞皮、甘草、桑白皮、川貝、地龍干、野菊花、冬瓜仁、車前子、天竺黃(均購(gòu)于廣州致信藥材有限公司),以上實(shí)驗(yàn)藥材經(jīng)田素英副教授鑒定均為正品。肺熱清解口服液(中山市黃圃人民醫(yī)院,批號(hào)20100825),雙黃連口服液(東莞市亞洲制藥有限公司,批號(hào)20112023),高活性酵母(安琪酵母股份有限公司,批號(hào)20110203),營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂(天津德晟生物技術(shù)有限公司,BG,20070621),水為無(wú)菌水,其它所用試劑均為分析純。1.3廣東東南角的清潔動(dòng)物房SPF級(jí)別,SD大鼠,購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;飼養(yǎng)于廣東藥學(xué)院中山校區(qū)的清潔動(dòng)物房?jī)?nèi),室內(nèi)濕度為70%±10%,溫度為(20±2)℃。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào):SCXK(粵)2008-0002。1.4病毒肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌(廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院微生物教研室提供)。2方法和結(jié)果2.1單因素方差分析使用SPSSV17.0對(duì)不同組別進(jìn)行單因素方差分析(F檢驗(yàn)),檢測(cè)各組間是否有顯著性差異,結(jié)果以(ˉx±s)表示;P<0.05說(shuō)明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2乙醇回收及乙醇萃取工藝按處方中(每種藥的1/50的重量)的中藥材粉碎后過(guò)4號(hào)(65目)篩,加10倍水,置燒杯中浸泡30min,水浴80℃加熱,提取2次,每次60min,過(guò)濾,合并濾液,低溫濃縮至約80ml。調(diào)節(jié)含醇量至70%,靜沉44h,取上清液回收乙醇,濃縮至30ml;先用乙醚萃取3次(每次30ml),收集上層(乙醚層);然后取下層用乙酸乙酯萃取3次(每次30ml),收集上層(乙酸乙酯層);合并乙醚、乙酸乙酯萃取液,再進(jìn)行濃縮;用無(wú)菌水將總黃酮提取物的濃度分別調(diào)整為每毫升含4g原藥材和每毫升含1g原藥材。2.3抗菌試驗(yàn)2.3.1菌種的培養(yǎng)取4支種管(4種菌種:肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌)和4支肉湯培養(yǎng)基管,在無(wú)菌情況下,挑取斜面上的菌苔少許,迅速將菌種移種到肉湯培養(yǎng)基管,將培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱培養(yǎng)18h。2.3.2溶解營(yíng)養(yǎng)豬肉粉液體培養(yǎng)基的制備:按質(zhì)量體積比2∶100的比例取營(yíng)養(yǎng)肉湯粉、蒸餾水置于三角燒瓶中,攪拌使?fàn)I養(yǎng)肉湯粉完全溶解,備用。制備固體培養(yǎng)基:按質(zhì)量體積比33∶1000的比例取營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂粉、蒸餾水置于三角燒瓶中,滅菌,冷至50～60℃時(shí),在無(wú)菌情況下將培養(yǎng)基傾注到無(wú)菌空平皿內(nèi)(直徑90mm平皿傾注大約20ml滅菌的培養(yǎng)基),凝固后即成平板培養(yǎng)基。2.3.3最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果采用連續(xù)(試管)稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)。取無(wú)菌試管10支進(jìn)行1～10編號(hào),分別向各試管加入2.0ml普通肉湯培養(yǎng)液;吸取藥物(肺熱清解口服液、4g/ml的總黃酮提取液)2.0ml加入到1號(hào)試管中,混勻后取2.0ml加入2號(hào)試管,依次稀釋到8號(hào)試管,吸出2.0ml棄去,分別標(biāo)出1～8號(hào)試管的濃度(肺熱清解口服液1～8號(hào)試管濃度:499.00,249.50,124.75,62.38,31.19,15.59,7.80,3.80;總黃酮1～8號(hào)試管濃度:2000.00,1000.00,500.00,250.00,125.00,62.50,31.25,15.63;原藥材mg/ml);其中9號(hào)試管為肉湯無(wú)菌生長(zhǎng)對(duì)照管,10號(hào)試管為細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照管;除9號(hào)試管外,用無(wú)菌移液管在其余的試管中加入上述菌種菌液0.1ml,混勻后置于37.0℃培養(yǎng)箱,孵育18h;觀察并記錄結(jié)果,未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度管即為藥物的最低抑菌濃度(MIC)。從上述無(wú)菌生長(zhǎng)的試管中(從MIC濃度低一級(jí)稀釋度開(kāi)始)中挑取培養(yǎng)液,劃線接種普通肉湯瓊脂平板,然后送37.0℃培養(yǎng)箱再培養(yǎng)24h,把平皿上菌落數(shù)<5個(gè)的最小藥物濃度作為最小殺菌濃度(MBC)(結(jié)果見(jiàn)表1)。從表1中可以看出,肺熱清解口服液對(duì)肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度、最小殺菌濃度均小于總黃酮的抑菌濃度,說(shuō)明肺熱清解口服液對(duì)上述的4種菌種的抑制強(qiáng)于總黃酮。2.3.4總黃酮的抑菌效果用無(wú)菌小刀在普通肉湯瓊脂平板上挖一條溝槽(大小根據(jù)瓊脂平板做決定,槽內(nèi)培養(yǎng)基棄去);在溝槽側(cè)邊緊挨溝槽垂直劃線接種上面4種菌種;用吸管將肺熱清解口服液、總黃酮提取液(原藥材4g/ml)、(原藥材1g/ml)、無(wú)菌水(陰性對(duì)照)、雙黃連口服液(陽(yáng)性對(duì)照藥物)分別加入普通肉湯瓊脂平板的溝槽內(nèi),以裝滿溝槽內(nèi)但不溢出為度。將平板平置于37.0℃恒溫箱培養(yǎng)24h;觀察各細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,測(cè)量溝槽與試驗(yàn)菌間的抑菌距離(結(jié)果見(jiàn)表2)。從表2中可以看出,挖溝法實(shí)驗(yàn)中,總黃酮在高濃度(原藥材4g/ml)時(shí),對(duì)肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌的抑菌效果均優(yōu)于肺熱清解口服液(原藥材0.498g/ml)的抑菌效果;但是,總黃酮在低濃度(原藥材1g/ml)時(shí),對(duì)肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌的抑菌效果均弱于肺熱清解口服液(原藥材0.498g/ml)的抑菌效果。2.4各組大鼠前近代前前感染情況的比較連續(xù)3d測(cè)量大鼠的肛溫,選肛溫差(△t)在3℃左右的大鼠均勻地分為4組,每組8只,分別為肺熱清解口服液組(口服液組)、總黃酮提取物組(原藥材1g/ml)(總黃酮組)、雙黃連口服液(陽(yáng)性組)、生理鹽水(空白組)。按組別分別給大鼠灌胃給藥(劑量:1ml/100g),連續(xù)4d早上給藥,第5天早上按1ml/100g的劑量給大鼠皮下注射10%酵母粉混懸液,其中空白組大鼠的肛溫升高>0.8℃時(shí)才計(jì)造模成功;在注射酵母的第3h,按分組給大鼠灌胃給藥(劑量:1ml/100g),并開(kāi)始測(cè)量大鼠的肛溫,以后每隔1h測(cè)量1次,測(cè)到第9h(共測(cè)量7次)即可(結(jié)果見(jiàn)圖1和表3)。從表3中可以判斷:肺熱清解口服液組與總黃酮組比較,具有顯著性差異的時(shí)間為第6h;肺熱清解口服液組與空白組比較,具有顯著性差異的時(shí)間為第3、4、5、9h?？傸S酮組與陽(yáng)性組比較,具有顯著性差異的時(shí)間為第5、6、7h;總黃酮組與空白組比較,具有顯著性差異的時(shí)間為第3、4、5、6、7、8、9h。陽(yáng)性組與空白組比較,具有顯著性差異的時(shí)間為第3、4、6、8h。從上述的結(jié)果可以判斷,肺熱清解口服液、總黃酮均有解熱的作用;而且,總黃酮在第3～8h的解熱效果略勝于肺熱清解口服液,特別是在第6h,兩者存在顯著性差異,說(shuō)明此時(shí)總黃酮的解熱效果強(qiáng)于肺熱清解口服液。3菌種的選擇及對(duì)10%酵母粉混懸液的抑菌效果抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肺熱清解口服液與處方中的總黃酮對(duì)肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌均有抑制作用;且肺熱清解口服液(原藥材0.498g/ml)抑菌效果比總黃酮(原藥材1g/ml)抑菌效果更顯著。從挖溝法抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出:當(dāng)處方中的總黃酮的濃度很高(原藥材4g/ml)時(shí),抑菌效果很顯著;但是低濃度(原藥材1g/ml)時(shí),抑菌效果比肺熱清解口服液(原藥材0.498g/ml)抑菌效果還差。肺熱清解口服液比雙黃連口服液的抑菌效果略差,這可能與兩者的處方組成不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)所選取的肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌都是肺部感染常見(jiàn)的菌種;本研究關(guān)于菌種的選擇是為了體現(xiàn)出肺熱清解口服液的功效和臨床應(yīng)用的特點(diǎn),符合中藥藥理研究思路的基本要求。解熱實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肺熱清解口服液和處方中的總黃酮均能夠?qū)?0%酵母粉混懸液引起大鼠發(fā)熱而解熱作用;除了第6h總黃酮的解熱效果明顯優(yōu)于肺熱清解口服液外,其他時(shí)間段中兩者不存在顯著性差異?？傸S酮在第3、4、5、6、7、8、9h均有明顯的解熱作用