氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿對血管內(nèi)皮細(xì)胞m受體基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用的比較

氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿對血管內(nèi)皮細(xì)胞m受體基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用的比較

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有重要的功能作用。乙酰膽堿（ach）可誘導(dǎo)表皮內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)張反應(yīng)，是評估血管內(nèi)皮細(xì)胞功能是否正常的經(jīng)典指標(biāo)。Khurana等在M3基因敲除小鼠主動脈上研究發(fā)現(xiàn):ACh誘發(fā)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)大大減弱,因此認(rèn)為主動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)主要是由M3介導(dǎo)的。Yamamada等采用同樣的方法研究認(rèn)為腦微動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)主要是由M5介導(dǎo)的。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)M受體亞型非選擇性激動劑毛果蕓香堿在濃度高達(dá)100μmol·L-1時(shí)仍不能誘發(fā)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng),而其他M受體亞型非選擇性激動劑如氨甲酰膽堿等均可誘發(fā)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng),這一現(xiàn)象在其他實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)得到證實(shí)。由此推論氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿對血管內(nèi)皮細(xì)胞M受體作用不同,氨甲酰膽堿可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞M受體,誘發(fā)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng),而毛果蕓香堿則不可。本文以氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿為工具藥,觀察二者對M受體各亞型基因表達(dá)的影響,在基因水平分析二者對內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)產(chǎn)生不同效應(yīng)的原因。1材料和方法1.1其他coearol和osti合酶產(chǎn)品DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、,TRlzol、SuperScriptTM為GibcoBRL公司產(chǎn)品;膠原酶、氨甲酰膽堿、毛果蕓香堿為Sigma公司產(chǎn)品;Oligo(dT)15、dNTP、RnasinⅠ、DNaseⅠ、TaqDNA聚合酶為Promega公司產(chǎn)品。GDS-8000凝膠成像儀為UVP公司產(chǎn)品。1.2em培養(yǎng)基急性分離牛主動脈,0.1%膠原酶消化內(nèi)皮細(xì)胞,接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基。取3～5代生長良好無雜細(xì)胞污染的內(nèi)皮細(xì)胞,換入含0.5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h,分別加入DMEM培養(yǎng)基、氨甲酰膽堿(carbachol)、毛果蕓香堿(pilocarpine),藥物終濃度為10-4mol·L-1,給藥后10h提取細(xì)胞總RNA。1.3總rna表達(dá)按TRIzol試劑盒操作方法提取細(xì)胞總RNA,加入DNaseⅠ以防止DNA污染,取少量做總RNA定量,調(diào)整濃度為1μg·μl-1,-70℃凍存。1.4go-dtdtpcr擴(kuò)增按SuperScriptTMⅡ推薦方法進(jìn)行,終體積20μl,其中總RNA5μl,500μg·μl-1Oligo(dT)151μl,10mnmol·L-1dNTP1μl,5×buffer4μl,0.1mol·L-1DTT2μl,RNasinⅠ1μl,SuperScriptTMⅡ1μl,Nucleasefreewater5μl。PCR擴(kuò)增儀上運(yùn)行:65℃5min,42℃50min,70℃15min;4℃保存。1.5-actin-mM受體各亞型和作為內(nèi)參照的β-actinPCR反應(yīng)寡核苷酸引物由上海博亞公司合成,引物序列見表1。PCR反應(yīng)終體積為25μl,其中50pmol·μl-1上下游引物、10mmol·L-1dNTP、5U·μl-1Taq酶各0.5μl,上述方法合成的第一鏈cDNA2μl,10×buffer2.5μl,ddH2O18.5μl。PCR反應(yīng)條件:94℃5min;94℃30s,61℃(M1、M3、M4、M5)/56℃(M2、β-actin)30s,72℃60s,35個(gè)循環(huán);72℃10min。β-actin和M受體各亞型用同一模板進(jìn)行擴(kuò)增。以模板為不經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄的總RNA作為陰性對照,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,UVPGDS-8000凝膠成像儀進(jìn)行圖像分析,P<0.05表示差異有顯著性。1.6統(tǒng)計(jì)處理采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用Dunnettu分析。2結(jié)果2.1雙鏈生物酶質(zhì)量比b細(xì)胞總RNA的OD260/OD280均大于1.8,說明RNA中蛋白質(zhì)和DNA殘量極少,RNA質(zhì)量可靠。將RNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,1.2%瓊脂糖凝膠電泳顯示雙鏈cDNA呈現(xiàn)為大小介于0.5kb到5kb之間的彌散條帶,說明制備的雙鏈cDNA質(zhì)量較好。以未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的總RNA進(jìn)行RT-PCR,未擴(kuò)增出特異條帶,作為陰性對照,以排除樣品中DNA污染。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示M受體5個(gè)亞型均出現(xiàn)了與預(yù)期長度相匹配的特異性條帶,部分基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測序,符合相應(yīng)GenBank數(shù)據(jù)(圖1)。用GDS-8000Labworks軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行圖像分析,以各基因條帶灰度值與相同模板β-actin條帶灰度值的比值作為mRNA表達(dá)的相對值,M,～M5的相對表達(dá)值分別為0.20±0.11、0.20±0.02、0.12±0.06、0.31±0.02、0.28±0.08(圖2)。2.2m受體的亞型氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿10-4mol·L-1分別作用于牛主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞10h后,M受體5個(gè)亞型mRNA表達(dá)量均顯著增加,與給藥前相比有顯著性差異(P<0.01,n=6),氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿之間無差異(圖3、4)。3民間海因基因激活氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿均為M受體非選擇性激動劑,能激活不同部位的M受體,但對血管內(nèi)皮上存在的M受體作用不同,具體表現(xiàn)為氨甲酰膽堿可以激活M受體,誘發(fā)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng),而毛果蕓香堿則不可。本研究發(fā)現(xiàn)氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿均能上調(diào)M受體5種亞型基因表達(dá),即二者均可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的M受體。氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿雖然均可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的M受體,但激活后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能不同,造成對血管張力影響的不同。Akam等利用免疫共沉淀技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)毛果蕓香堿不能激活Gq蛋白