二羥異黃酮對(duì)胃癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響

二羥異黃酮對(duì)胃癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響

除了良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，還發(fā)現(xiàn)了它具有廣泛的生物學(xué)活性，對(duì)心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)退行性病變和癌癥的防治和治療發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn),大豆的生物活性是緣于其含有的大豆異黃酮成分。大豆異黃酮(soybeanisoflavone)共有12種,主要成分為染料木黃酮(三羥異黃酮genistein)和大豆苷原(二羥異黃酮daidzein)。關(guān)于大豆異黃酮抗腫瘤作用的研究,多見(jiàn)于乳腺癌和前列腺癌等性激素依賴(lài)性腫瘤。最近國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),染料木黃酮可抑制非性激素依賴(lài)性腫瘤——胃癌細(xì)胞的惡性增殖,解釋了大豆的抗癌作用。胃癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一,在腫瘤死亡率中居第一位。因此,本研究采用大豆苷原處理體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞,然后測(cè)定細(xì)胞增殖的變化,重點(diǎn)觀察其對(duì)細(xì)胞周期的影響,以探討大豆防治胃癌的可能機(jī)制。1材料和方法1.1試劑和試劑盒人胃黏膜腺癌細(xì)胞系MGC-803,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液為美國(guó)GibcoBRL公司產(chǎn)品。小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)LIT公司。DNA純化試劑盒購(gòu)自上海中鼎生物技術(shù)公司。二羥異黃酮(純度不低于98%)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室韓正康教授惠贈(zèng)(該室化學(xué)合成)。DNA熒光素染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)BeckmanCoulter公司。Epicselite型流式細(xì)胞儀為美國(guó)BeckmanCoulter公司生產(chǎn)。1.2細(xì)胞培養(yǎng)胃癌細(xì)胞MGC-803置于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,37℃、5%CO2培養(yǎng),弱光下?lián)Q液一次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。1.3dmso體積配比用二甲基亞砜(DMSO)溶解二羥異黃酮,然后再用培養(yǎng)液制備使成終濃度分別為0.1、1.0、10、50、80、100μmol/L的含藥培養(yǎng)液,調(diào)整DMSO的體積百分比,使各組均為0.1%。1.4含藥培養(yǎng)液制備將培養(yǎng)好的細(xì)胞用胰酶常規(guī)消化后,用基礎(chǔ)培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4.0×104/ml,按每孔200μl接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24h后加入含藥培養(yǎng)液,每組共12孔。另設(shè)溶劑對(duì)照組(0.1%DMS0)。藥物處理細(xì)胞2d后,去除培養(yǎng)液,加入MTT溶液(5mg/ml,溶解于PBS液中)30μl/孔,再培養(yǎng)4h后倒盡培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液,加入DMSO(150μl/孔),室溫下振蕩10min,待成色產(chǎn)物溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)A值(λ=570nm,630nm雙波長(zhǎng)測(cè)定)。1.5dna熒光素染色在藥物處理2d后收集細(xì)胞,以PBS洗滌2次,然后加DNA熒光素染色。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析,測(cè)出的直方圖用Multicycle軟件處理,算出細(xì)胞各周期的DNA相對(duì)含量和百分?jǐn)?shù)。1.6細(xì)胞內(nèi)dna的提取用不同濃度的大豆苷原分別處理細(xì)胞2d后,用胰酶消化并收集到離心管中,4000r/min離心5min,棄上清,再用2mlD-Hank’s液重懸細(xì)胞,同法離心10min,棄上清,用DNA純化試劑盒提取DNA。樣品用1.5%瓊脂糖凝膠按50V電泳1h,經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像儀中觀察DNA條帶。1.7統(tǒng)計(jì)處理用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2結(jié)果2.1藥物作用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響在大豆苷原作用下,胃癌細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量發(fā)生了明顯的變化。低濃度(0.1～1μmol/L)藥物作用下,細(xì)胞數(shù)量增多,表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用;當(dāng)藥物濃度在10～100μmol/L時(shí),細(xì)胞數(shù)量變少、體積變小、輪廓不規(guī)則,易從培養(yǎng)板表面脫落,表現(xiàn)出抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用(圖1)。2.2大豆苷原對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同濃度的大豆苷原對(duì)MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同,從MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,在10～100μmol/L之間,大豆苷原對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,而以50、80和100μmol/L濃度時(shí)抑制作用更明顯(P<0.01,表1)。在0.1～μmol/L間,它對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)則有促進(jìn)作用,而在0.1μmol/L濃度時(shí)更明顯(P<0.05,表1)。表現(xiàn)為一種雙相作用。2.3大豆苷原的細(xì)胞周期經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析,10～100μmol/L的大豆苷原各組的細(xì)胞周期分布均發(fā)生了顯著變化,G1期細(xì)胞數(shù)比例增加明顯,G2期、S期細(xì)胞數(shù)減少,凋亡峰(亞G1峰)不明顯(圖2)。2.4瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖3大豆苷原處理細(xì)胞后,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳未見(jiàn)明顯的DNA凋亡梯形條帶。3大豆苷原的抗氧化作用大豆異黃酮是一種植物雌激素,它可以與雌激素受體結(jié)合而對(duì)體內(nèi)雌激素具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制或拮抗作用。調(diào)查發(fā)現(xiàn),亞洲國(guó)家居民前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌以及心血管疾病的發(fā)病率遠(yuǎn)低于西方發(fā)達(dá)國(guó)家的一個(gè)主要原因是亞洲居民大豆的消費(fèi)量遠(yuǎn)大于西方發(fā)達(dá)國(guó)家。染料木黃酮是大豆中最主要的黃酮類(lèi)化合物,除對(duì)乳腺癌、前列腺癌等性激素相關(guān)性疾病有防治作用外,對(duì)胃癌等非激素相關(guān)性疾病也有一定防治作用。大豆苷原是大豆異黃酮的另一種主要成分,其抗癌機(jī)制尚未完全闡明。本研究結(jié)果表明,不同濃度的大豆苷原對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同,在低濃度時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖而在高濃度時(shí)卻抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并影響細(xì)胞周期。Messina等報(bào)道,染料木黃酮對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響也呈雙相效應(yīng),而且其抗癌效應(yīng)可經(jīng)雌激素受體和非激素受體兩種不同的途徑。這說(shuō)明:一方面,這二類(lèi)主要的大豆異黃酮在作用形式(雙相性)和作用對(duì)象(性激素相關(guān)和非性激素相關(guān)疾病)等方面具有—定相似之處;另一方面,使用大豆異黃酮防治有關(guān)腫瘤時(shí)需要達(dá)到一定劑量才可能有效。Watanabe等研究了健康