放射毛霉產(chǎn)中性蛋白酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

放射毛霉產(chǎn)中性蛋白酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

發(fā)酵食品在中國已有幾千年的歷史。發(fā)酵豆制品不僅味美、營養(yǎng)豐富,而且具有降低膽固醇、降血壓、抗氧化等多種保健功能。腐乳是在豆腐生產(chǎn)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的發(fā)酵型大豆食品之一,在腐乳生產(chǎn)過程中有多種微生物和酶參與,其共同作用造就了腐乳的獨特風(fēng)味,也正因其獨特的工藝、細(xì)膩的品質(zhì)、豐富的營養(yǎng)及鮮香可口的風(fēng)味深受消費者喜愛。腐乳發(fā)酵階段可分為前期培菌和后期發(fā)酵。前期培菌是在半開放條件下培養(yǎng)微生物的酶系;后期發(fā)酵主要是酶系與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過程。腐乳生產(chǎn)中所用的發(fā)酵菌種主要是毛霉,如雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)、五通橋毛霉(wutungkiaomucor)、腐乳毛霉(Mucorsufu)等,它們具有分泌蛋白酶、肽酶及其他酶系的功能,其中蛋白酶能進(jìn)行蛋白質(zhì)的降解。通過對毛霉菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化,提高毛霉菌株產(chǎn)中性蛋白酶的酶活力,其目的在于縮短腐乳發(fā)酵周期,提高腐乳的生產(chǎn)效率。1材料和方法1.1gkioamocor菌株雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)菌種編號3118、五通橋毛酶(WutungkiaoMucor)菌種編號40477:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;蔗糖(分析純):北京奧博星生物技術(shù)有限公司;硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣(分析純):天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心;黃豆粉、磷酸緩沖液、TCA、福林酚、酪蛋白、碳酸鈉、鹽酸溶液、氫氧化鈉(分析純):西隴化工股份有限公司。1.2hzq-fps試驗儀器手提式壓力蒸汽滅菌器:浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;無菌操作臺:北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱:哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;電子天平:北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;80-2B型臺式低速離心機:湖南星科科學(xué)儀器有限公司;722E型可見分光光度計:上海光譜儀器有限公司;SY-2-4電熱式恒溫水浴鍋:天津歐諾儀器儀表有限公司。1.3實驗方法1.3.1離心20min取出發(fā)酵液于80目的網(wǎng)篩過濾去菌絲,之后將濾液在4000r/min下離心20min;取1.0mL濾液于100.0mL容量瓶中,用磷酸緩沖溶液定容至100.0mL,即制得稀釋酶液。1.3.2中立酶活性測定按照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T23527-2009),采用Folin-酚法測定中性蛋白酶活力。1.3.3培養(yǎng)時間和發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph值確定(1)培養(yǎng)溫度對毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響以10%的蔗糖、3%的黃豆粉、0.35%KH2PO4和0.1%CaCl2(五通橋毛霉為蔗糖8%、0.4%KH2PO4、0.08%CaCl2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基,每500mL三角瓶裝液量150mL,調(diào)節(jié)pH6.0,0.1Mpa、121℃滅菌30min。冷卻后接入孢子數(shù)為×106、2%的毛霉孢子懸液,分別置于26℃、28℃、30℃、32℃、34℃下培養(yǎng)60h,充分發(fā)酵后制成粗酶液,然后測定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力,確定最佳培養(yǎng)溫度。(2)培養(yǎng)時間對毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基在相同條件下滅菌、冷卻后接入孢子數(shù)為×106、2%的毛霉孢子懸液,分別置于30℃(五通橋毛霉為26℃)下,培養(yǎng)36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h,充分發(fā)酵后制成粗酶液,然后測毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力,確定最佳培養(yǎng)時間。(3)接種量對毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響將接種量為6%、8%、10%、12%、14%、16%的毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH為6.5,滅菌冷卻后,分別置于30℃下(五通橋毛霉為26℃),培養(yǎng)72h,充分發(fā)酵后制成粗酶液,然后測毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力,確定最適接種量。(4)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響調(diào)節(jié)毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,滅菌冷卻后,接入10%的毛霉孢子懸液(五通橋毛霉為8%)分別置于30℃下(五通橋毛霉為26℃),培養(yǎng)72h,充分發(fā)酵后制成粗酶液,然后測毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力,確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH。(5)裝液量對毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響向500mL的三角瓶中分別裝入75mL、100mL、150mL、175mL、200mL的發(fā)酵培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH為6.5,滅菌冷卻后,接入10%的毛霉孢子懸液(五通橋毛霉為8%),分別置于30℃下(五通橋毛霉為26℃),培養(yǎng)72h,充分發(fā)酵后制成粗酶液,然后測毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力,確定最適裝液量。(6)振蕩速度對毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響將裝液量為175mL的發(fā)酵培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH為6.5,滅菌冷卻后,接入10%的毛霉孢子懸液(五通橋毛霉為8%),置于30℃下(五通橋毛霉為26℃),分別以100rpm、125rpm、150rpm、175rpm、200rpm、225rpm的振蕩速度,培養(yǎng)72h,充分發(fā)酵后制成粗酶液,然后測定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力,確定最適振蕩速度。(7)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化根據(jù)上述單因素實驗,以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為4因素,以毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力為指標(biāo),進(jìn)行正交優(yōu)化實驗。2結(jié)果與分析2.1溫度對2種常用的培養(yǎng)基溫度的影響從圖1可知,對于雅致放射毛霉,溫度在24~30℃,隨著溫度的升高,雅致放射毛霉的蛋白酶活力逐漸增加,中性蛋白酶酶活力達(dá)1388.37U/mL;溫度超過30℃后,雅致放射毛霉的生長受到抑制,蛋白酶活力開始下降。因此,雅致放射毛霉的最佳培養(yǎng)溫度為30℃。對于五通橋毛霉:最佳培養(yǎng)溫度為26℃,此條件下,中性蛋白酶酶活力達(dá)1370.89U/mL。2.2中性蛋白酶酶活力從圖2可知,無論雅致放射毛霉還是五通橋毛霉,隨著培養(yǎng)時間的增加,毛霉開始大量繁殖生長,菌絲體產(chǎn)生孢子,分泌蛋白酶,36~60h期間蛋白酶酶活力上升最快,到72h時,中性蛋白酶酶活力達(dá)到最大值,分別為1494.11U/mL和1466.34U/mL。隨后蛋白酶酶活力逐漸降低。這是由于隨著培養(yǎng)時間的增加,毛霉菌絲體迅速老化,從而減慢了分泌蛋白酶的速度。因此,2種毛霉菌的最佳培養(yǎng)時間為72h。2.3蛋白酶酶活力從圖3可知,隨著接種量的增加,毛霉生長速度加快,酶活力逐漸升高,對于雅致放射毛霉,當(dāng)接種量達(dá)到10%時,中性蛋白酶酶活力達(dá)到最大值1495.11U/mL;當(dāng)接種量超過10%時,蛋白酶酶活力開始出現(xiàn)下降趨勢;同樣分析可知,五通橋毛霉接種量為8%時,中性蛋白酶酶活力達(dá)到最大值1488.79U/mL,此后隨著接種量的增加蛋白酶酶活力降低。由于菌絲體生長繁殖所消耗的營養(yǎng)增多,產(chǎn)生較多的代謝產(chǎn)物,使菌體細(xì)胞外環(huán)境惡化,菌絲體較早衰老退化。綜上所述,雅致放射毛霉和五通橋毛霉的最佳接種量為10%和8%。2.4ph對中性蛋白酶酶活力的影響發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值過低或過高都會對毛霉生長產(chǎn)生不利影響。從圖4可知,培養(yǎng)基的初始pH值在5.0~6.5的范圍內(nèi),蛋白酶酶活力一直呈明顯上升趨勢(P<0.05),當(dāng)pH值為6.5時,2種毛霉菌的中性蛋白酶酶活力達(dá)最高1690.68U/mL和1593.39U/mL。而pH繼續(xù)升高,蛋白酶酶活力則迅速下降。因此,發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值應(yīng)控制在6.5左右。2.5裝液量對蛋白酶酶活力的影響由圖5可知,裝液量在50~75mL時,蛋白酶酶活力的差異不明顯;裝液量在75~150mL時,隨著搖瓶裝液量的增加,蛋白酶酶活力呈明顯上升趨勢;當(dāng)裝液量達(dá)175mL時,中性蛋白酶酶活力達(dá)最大值1752.71U/mL和1715.34U/mL。當(dāng)裝液量超過175mL時,蛋白酶酶活力出現(xiàn)下降趨勢。從實驗結(jié)果和經(jīng)濟角度考慮,選擇175mL的裝液量就可以滿足毛霉對于溶氧的需求。由圖6可知,隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的提高,溶氧濃度加大,蛋白酶酶活力呈明顯上升趨勢(P<0.05),當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)175~200r/min,中性蛋白酶酶活力基本達(dá)到最大值1768.12U/mL和1737.02U/mL;當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速大于200r/min時,酶活力增加速度趨緩,并有下降趨勢。說明再增加通氣量會導(dǎo)致細(xì)胞呼吸強度加大,細(xì)胞生長速度過快而影響產(chǎn)酶。因此,本實驗選擇搖床轉(zhuǎn)速為175r/min。2.6正交優(yōu)化促進(jìn)條件2.6.1不同培養(yǎng)條件對有關(guān)放射性水泥納米專二型思想中第一、雙通過雅致放射毛霉培養(yǎng)條件優(yōu)化實驗得到了雅致放射毛霉培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH、接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響情況,通過極差分析得出4種因素的影響順序C>B>A>D,即pH>培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度>接種量。從表1及圖7可知:雅致放射毛霉菌產(chǎn)中性蛋白酶的最佳培養(yǎng)條件為A2B2C3D1,即最佳培養(yǎng)條件是培養(yǎng)時間72h、培養(yǎng)溫度30℃、pH6.8、接種量9%。經(jīng)驗證此條件下的雅致放射毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力為1967.36U/mL。2.6.2基于正交試驗結(jié)果的數(shù)據(jù)分析根據(jù)單因素實驗得出培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH、接種量這4個因素較其他因素對發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著性(P<0.05),確定出相應(yīng)因素的顯著實驗數(shù)值,進(jìn)行正交實驗,采用SPSS17.0進(jìn)行分析,結(jié)果見表2。通過五通橋毛霉培養(yǎng)條件優(yōu)化實驗確定了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH、接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響情況,通過極差分析得出4種因素的影響順序C>A>B>D,即pH>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間>接種量,其中發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對蛋白酶酶活的影響較為明顯(P<0.05),其次為培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接種量。從表2及圖8可知,五通橋毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的最佳培養(yǎng)條件為A3B3C2D1,即培養(yǎng)溫度27℃、培養(yǎng)時間78h、培養(yǎng)基初始pH6.5、接種量7%,經(jīng)驗證此條件下的五通橋毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力為1896.53U/mL。3最佳發(fā)酵條件的確定本實驗以雅致放射毛霉和五通橋毛霉為出發(fā)菌株,研究不同溫度和時間、初始pH值、接種量條件下對毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響。實驗具體結(jié)論如下:雅致放射毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的最佳培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)時間72h、培養(yǎng)溫度30℃、pH6.8、接種量9%,在上述發(fā)酵條件下,中性蛋白酶酶活力達(dá)196