去勢(shì)大鼠骨形成過(guò)程中骨吸收指標(biāo)的變化及其相關(guān)性研究

去勢(shì)大鼠骨形成過(guò)程中骨吸收指標(biāo)的變化及其相關(guān)性研究

骨轉(zhuǎn)化生化指標(biāo)反映了血液和尿液中各種物質(zhì)的骨吸收和形成。反映骨形成的生化指標(biāo)主要有血清骨鈣素(osteocalcin,OC)、血清總堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨堿性磷酸酶(bone-specificalkalinephosphatase,BALP)和血清Ⅰ型前膠原C末端前肽(procollagentypeⅠCpropeptide,PICP)。反映骨吸收的生化標(biāo)志物主要有血清抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP)、血、尿羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)、尿Ⅰ型膠原N末端交聯(lián)肽(N-terminalcross-linkingtelopeptideoftypeⅠcollagen,NTX-1)和尿脫氧吡啶酚(deoxypyridinoline,DPD)。骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的研究對(duì)闡明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制、預(yù)測(cè)絕經(jīng)后骨量的丟失、尋找早期診斷和觀察藥物療效的靈敏指標(biāo)具有重要意義。2003年,Legrand等研究去勢(shì)老年雌猴模型中一些標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化,2004年Miyazaki等報(bào)道去勢(shì)大鼠術(shù)后一些骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)隨時(shí)間的變化趨勢(shì),我室曾對(duì)去勢(shì)兔血清TRAP和BALP的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究。本研究擬對(duì)去勢(shì)大鼠模型形成過(guò)程5種骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)(OC、ALP、BALP、TRAP和HYP)的變化及其相關(guān)性進(jìn)行研究,從而預(yù)測(cè)它們?cè)诮^經(jīng)后早期骨量丟失中的意義。材料和方法1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3月齡SD雌性大鼠48只,平均體重(183±23)g,由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2高溫水浴箱UV-265型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司),DG3022A型酶標(biāo)儀(南京華東電子管廠),IB-85型超級(jí)恒溫水浴箱(日本島津公司),40孔微量反應(yīng)板(浙江黃巖拱東塑料制品廠);對(duì)硝基酚磷酸二鈉鹽(PNPP)購(gòu)自德國(guó)Merck公司,酒石酸鈉及對(duì)硝基酚購(gòu)自成都化學(xué)試劑廠,其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。2方法2.1對(duì)照組控制隨機(jī)將大鼠分為3組:去勢(shì)組即卵巢切除組(OVX)30只,假手術(shù)組(sham)12只,對(duì)照組(control)6只。平衡膳食1周后,OVX和sham大鼠在3%戊巴比妥鈉腹腔注射(35mg/kgBW)麻醉下進(jìn)行手術(shù),OVX開(kāi)腹后切除雙側(cè)卵巢,sham僅開(kāi)腹,不切除卵巢,兩組均縫合腹腔、閉合傷口,分組分籠復(fù)合飼料飼養(yǎng)。2.2術(shù)后時(shí)間檢查術(shù)前對(duì)照組心臟采血,分離血清于-30℃保存。OVX組和sham組術(shù)后分別于1、1.5、2、2.5、3和4月6個(gè)時(shí)點(diǎn),乙醚麻醉大鼠(OVX組5只,sham組2只)后從心臟采血,分離血清于-30℃保存,處死大鼠后分離右腿脛骨,浸泡于10%甲醛溶液中,留作病理切片檢查。2.3trap活性的檢測(cè)血清中OC的含量采用間接ELISA法檢測(cè)。血清總ALP和BALP采用熱失活法檢測(cè)。BALP=總ALP-肝ALP。以37℃,pH9.8,每分鐘催化生成1μmol對(duì)硝基酚的酶量為1個(gè)酶活性單位(U)。采用對(duì)硝基酚磷酸鹽法檢測(cè)TRAP活性。以37℃,pH5.5,在80mmol/L酒石酸鈉存在條件下,每分鐘催化生成1μmol對(duì)硝基酚的酶量為1個(gè)酶活性單位(U)。血清中的HYP含量用鹽酸水解法進(jìn)行檢測(cè)。2.4骨小梁的變化和破骨細(xì)胞的觀察將大鼠右腿脛骨近端1/3沿冠狀面磨平,常規(guī)甲醛固定,10%EDTA脫鈣,石蠟包埋處理后切片,HE染色,在光鏡下觀察骨小梁的變化和成骨、破骨細(xì)胞的數(shù)量并攝像。3統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,差異分析用方差分析和t檢驗(yàn),相關(guān)分析用Pearson分析法。結(jié)果1各組小鼠血清oc、alp、balp水平大鼠血清OC、ALP和BALP的水平見(jiàn)表1。表1顯示:OVX組血清OC、ALP和BALP水平均高于sham組,其中OVX組血清BGP含量在術(shù)后1.5-3月與sham組比差異顯著,OVX組血清ALP和BALP水平在術(shù)后1.5-4月與sham組比均差異顯著。2ovx組血清alp活性在術(shù)后由圖1所示,OVX組血清OC的含量在術(shù)后迅速升高,并在2月達(dá)峰值,然后迅速下降,術(shù)后4月降至術(shù)前水平;OVX組血清ALP活性在術(shù)后緩慢上升,在術(shù)后2.5月達(dá)峰值,然后緩慢下降,4月時(shí)仍高于術(shù)前水平;BALP在術(shù)后的上升與血清ALP相似,在術(shù)后2.5月達(dá)峰值,然后迅速下降,3月時(shí)降至術(shù)前水平。3血清trap活性和hyp含量大鼠血清TRAP和HYP水平見(jiàn)表2。表2表明,OVX組血清TRAP活性和HYP含量均高于sham組,且在術(shù)后1-4月與sham組比均差異顯著。4兩組活性和hyp含量的比較由圖2所示,OVX組血清TRAP活性和HYP含量的變化相似:在術(shù)后迅速升高,并在術(shù)后1.5月達(dá)峰值,然后下降,術(shù)后4月時(shí)仍高于對(duì)照組。5家庭暴力0.713去勢(shì)大鼠血清OC含量與血清ALP、BALP、血清TRAP水平和血清HYP含量均呈非常顯著正相關(guān)(r=0.448、0.730、0.388和0.292,P<0.01);血清ALP水平與BALP、血清TRAP和HYP水平呈非常顯著正相關(guān)(r=0.739、0.420和0.313,P<0.01);BALP水平與血清TRAP和HYP水平呈非常顯著正相關(guān)(r=0.569和0.424,P<0.01);血清TRAP水平和HYP含量呈非常顯著正相關(guān)(r=0.690,P<0.01)。6兩組患者術(shù)后3月軟骨小梁變細(xì)、排列稀疏、斷裂率比較OVX組術(shù)后1-2.5月其脛骨小梁結(jié)構(gòu)正常(結(jié)果未顯示)。由圖3可見(jiàn),與sham組相比,OVX組術(shù)后3月脛骨小梁變細(xì),排列稀疏,部分?jǐn)嗔?圖3B);OVX組術(shù)后3月脛骨小梁周?chē)某晒呛推乒羌?xì)胞增生活躍(圖3D)。骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)去勢(shì)大鼠是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制和觀察藥物療效的經(jīng)典動(dòng)物模型。目前已有多種手段來(lái)監(jiān)測(cè)動(dòng)物模型的骨組織狀態(tài),包括骨組織形態(tài)學(xué)觀察、骨密度測(cè)量、骨生物力學(xué)研究和骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)的檢測(cè)等,其中生化指標(biāo)的檢測(cè)具有簡(jiǎn)便、快速、無(wú)創(chuàng)傷性、可以對(duì)骨組織進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。我們選用3月齡雌性大鼠摘除卵巢建立動(dòng)物模型可排除老年性原因引起的骨質(zhì)疏松,從而研究單純由于雌激素缺乏所致的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。病理切片顯示:術(shù)后3月去勢(shì)組大鼠脛骨小梁變細(xì)、稀疏、部分?jǐn)嗔训?說(shuō)明絕經(jīng)后大鼠骨質(zhì)疏松模型復(fù)制成功。骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果表明,OVX組骨形成和骨吸收指標(biāo)的水平均高于sham組,術(shù)后3月,骨吸收指標(biāo)TRAP處于高水平,而骨形成指標(biāo)BALP已降至術(shù)前水平,這說(shuō)明絕經(jīng)后骨吸收和骨形成之間的平衡被破壞,使骨吸收超過(guò)骨形成,為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松。本研究結(jié)果表明,骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)OC、ALP、BALP和TRAP的變化趨勢(shì)與Legrand等和Miyazaki等研究結(jié)果相似,只是達(dá)峰值的時(shí)間不同。我們估計(jì)是所用動(dòng)物種系、檢測(cè)的時(shí)點(diǎn)及檢測(cè)方法不同所致。在去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型形成過(guò)程中,如果以達(dá)峰值時(shí)間為準(zhǔn),骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)發(fā)生變化的先后順序依次為:TRAP/HYP→OC→ALP/BALP,這說(shuō)明骨吸收的變化先于骨形成的變化,即破骨在前,成骨在后。摘除卵巢后,雌激素缺乏,首先激活破骨細(xì)胞,啟動(dòng)骨吸收過(guò)程;繼而促使成骨細(xì)胞活性代償性升高,進(jìn)行骨形成作用。這可能是雌性絕經(jīng)后骨轉(zhuǎn)換增強(qiáng),骨代謝處于負(fù)平衡,而使骨量快速丟失的原因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,5種骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)(OC、ALP、BALP、TRAP和HYP)之間均呈顯著正相關(guān),說(shuō)明骨吸收和骨形成不是獨(dú)立的過(guò)程,而是相互聯(lián)系和相互調(diào)節(jié)的。其中ALP和BALP的相關(guān)性最高(r=0.739),提示血清ALP的變化主要是由骨源性BALP引起的。有報(bào)道去勢(shì)雌猴血清OC和ALP、ALP和BALP之間呈顯著正相關(guān),與本研究結(jié)果一致,去勢(shì)模型中其它指標(biāo)之間的相關(guān)性目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,去勢(shì)組大鼠骨質(zhì)疏松的病理變化一般在術(shù)后3月才能從切片觀察到,而