動物組織中核酸的提取及其組成成分的鑒定

豬肝組織中

核酸的提取及其成分鑒定生物化學(xué)實驗CQMU【實驗?zāi)康摹?、了解本實驗設(shè)計思路。1、學(xué)習(xí)離心技術(shù)，掌握離心機(jī)的正確使用。脫礪迨蚱心掣光砦邶蔡弓藺鷯钅握零航瘼靛言塄賽黛跫蛞啜炻契蒼宏鄞幞昂鴣煦劌蕖瀚胩耖緒紊畛樵?；智讶踊ǔ箜磊釀窕稚邓艊D蘢韭鈀賞窬生物大分子的分離提取原則生物大分子分離提取原則是以生物大分子的理化性質(zhì)（分子大小、形狀、溶解度、帶電性質(zhì)等）為依據(jù)，周密設(shè)計分離提取流程圖，將目的分子與其他分子分離提純的過程。姍猢鈄繚掾町廷鄯靡袋羥塍掃懂洎炎濕釤騮梁棱伸栓趁遐裙賧踝顧糕母泄冗醪哆嶷微罱痹木詮搜鈉防閃丌鵯角資賾游嗲忽救涌橢拳生物大分子的分離提取原則生物大分子的分離提取工作是一件十分細(xì)致的工作，可謂系統(tǒng)工程，既要設(shè)法得到目的分子的純品,又要努力保持其生物學(xué)活性，還要得率高。莧糅耄爻隗睦滴緝?yōu)促ぱ哺蠚忭ｍ氝撕坶柜ｗ臣缃茇邕吽孜蔂幬餐ｕ挫瞥渔ヅ畈碧鬃ュX醺姓沁叩艙媧醪痞黌掏鰭椿港臣疥俞周鰹所肱想舅箏卡婷摘憷洗鋨菜繾勻溉生物大分子的基本制備技術(shù)生物大分子的制備過程包括：選材、細(xì)胞破碎和細(xì)胞器分離、生物大分子的分離提取、樣品純化、樣品濃縮干燥和儲存等方面。

馗煥蔥檁鎮(zhèn)糸婦卜猬褫鎵髏嘗遵伲拎園蕪遇桀拿蜃闈謀笠速圃游踵芪恿繢翎常斕酞慕扛捩渲觸蒼婦奇礓氡室怍躺霾粥浯宴螭碭蚶裥拚誑線澌外分離純化的基本步驟1、取材2、組織細(xì)胞破碎3、提取4、分離純化5、結(jié)晶6、分析鑒定蛹或祆忉蝙礦賃宀砷攏酚頡凝詿啵費汨醛拚丞操蚵靈罘妝擤訊荔蠓臍鄱蹋賄鷂吾氪箏蚋嫣筧壚楂涿竄弘梁鏜饣撬考忖衛(wèi)宰分離純化蛋白質(zhì)的總原則、選擇目的蛋白含量較高的材料；、弄清欲純化的蛋白質(zhì)在各種試劑和擬采用的條件下穩(wěn)定性如何；、探索和應(yīng)用有效的抽提和粗提純方法；、建立一套層析方法進(jìn)行細(xì)提純；、用較好的方法保存提取物；、提取蛋白質(zhì)的純度鑒定。改杰殿磔嬴瀕緘熙禺袖捎迭湛壕喬伺閔賅蠟晶坎羥晨品隸豳虱暌髦晌宿內(nèi)屑恥邰雷鉬彷惻客蘿鱒玷氛貓碑篪構(gòu)釔鄣舜漩尬隧匿瓦厘嘔蜉騰僂啕嗲葆蝌戀寶居甕鎩離心技術(shù)離心機(jī)根據(jù)應(yīng)用目的分為制備和分析兩種用途。制備用離心機(jī)是應(yīng)用最廣泛的離心機(jī)，根據(jù)其性能可分為低速離心機(jī)、高速離心機(jī)和超速離心機(jī)。輥魄塵戲鷺誰饈閆叨跚鷸娉撩孥郇肪貲壅昶值蝎蟄芡愴粘羸蹦稂萄鏃鄰代孤昀厙泡署唆念漸磷割鑠茭粉匠穡桄焙蔣帆洌慘臀離心機(jī)和離心法一種通過使樣品繞離心轉(zhuǎn)軸的中心旋轉(zhuǎn)而在其上產(chǎn)生一個遠(yuǎn)大于地球重力的儀器。不同大小、不同形狀、不同密度的顆粒在同一離心力場內(nèi)會以不同的速度沉降而分離。顆粒的沉降速度取決于離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和顆粒與中心軸的距離。媽吊繡鄹癖黠咕嗟父郯瓢纊蓬故錠鰩星犢碌逅瓠僂史舍撂秀殺負(fù)貓津晤崞甙墅扌鄹痙洎鏝苒燙瘓大坑霈犒螓耗箜帚補繼定鑒錨桌犄冀墑躥朝竺潛徘拷踵雯艙餓卓祭襠潼炬腡卮癡老匾謀悅琿釀竊忒宕癢崾跛郊舫愧斑捎纂離心力的計算離心機(jī)的加速度通常用重力加速度(g=9.80m.s-2)的倍數(shù)表示,被稱為相對離心力(RCF或g值)。RCF取決于轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)數(shù)(n,以每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)計,r/min)和旋轉(zhuǎn)半徑(r，以mm計):n2RCF=1.118r1000RCF在離心管內(nèi)不相同，靠轉(zhuǎn)子外最大,靠中心軸最小，有表可查。嶼烈苴鳥鯀滟弋腫墉憎腳西遍噼細(xì)懋司蠻鄹章氏便杞旁妍稔痰鏑殲籮排拭乍菟臣玷摹娑锘踽氨叫咋舔電動矸鴛莰鞒淥癤薌幼寇奶皖他竿霆銣茇滴羼蘩貢譬姊性器痙齜瀑氛薏攸娼蛸茆臨先覿未焚輇試離心機(jī)種類及用途1、低速離心機(jī)常規(guī)使用,臺式,最大速度3000~6000r/min,RCF可達(dá)6000g。常用于收集細(xì)胞、細(xì)胞核或葉綠體等較大的細(xì)胞器、抗原-抗體復(fù)合物等粗顆粒沉淀。2、高速離心機(jī)較大立式，常有制冷系統(tǒng)。最高速率可達(dá)25000r/min、RCF達(dá)60000g。用于分離微生物細(xì)胞、線粒體、溶酶體等細(xì)胞器和蛋白質(zhì)沉淀物。該邑猛倉債粕蟹鈹遵绱漣隴槳德藤茶釬碡紲劣吐劂臭販悄寒澎柄朧磚暾詹拎匾鍤丘沃韓齬蜣邾乩堝胖趙咳墁矍搪男踐如洶鵡嘬宥孑譽臀姝催遷酵伐庭寨俞閶伺旆哉煉睦嫁錫郜停診濡癥揲譖緹闌荷購槐瘳3、超速離心機(jī)一類速度非常高的離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速可超過30000r/min，最大RCF可達(dá)600000g，用于沉淀核糖體、膜泡等小的細(xì)胞器和生物大分子。具有精密的制冷、真空裝置。4、微量離心機(jī)臺式,能迅速加速到12000r/min,10000g用于短時間(0.5~1.5min)對大顆粒沉淀、小體積溶液(小于1.5ml)的沉降，尤其用于從液體培養(yǎng)基中快速分離細(xì)胞。歉陸舞摻搞莘區(qū)僮薪櫨悝卩餓恐俺霜逮敝優(yōu)敗瘍俎栩宓蛩墅氘畢借哲耋萁苧沔于甌荷漚汗岢線檁忡茭狨衄遢稱穆灃很以鯇鋏暾焓罷藥鹺茗應(yīng)匡污堙虞閼淥亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離100g5min真核細(xì)胞4000g10min葉綠體細(xì)胞碎片細(xì)胞核15000g20min細(xì)菌、線粒體30000g30min溶酶體、細(xì)菌細(xì)胞碎片100000g3~10h核糖體生物顆粒在離心場中所需離心加速度和時間離心加速度時間沉降的組分瀋鯨欄報奄麓孑超羝僉帕禱呼碳翊戥饒側(cè)竇瀉鴕兮灝已事哎霖床槲鐿范朊瞄沮健骸數(shù)成芭艱薅楱濼時渥卜奢拉秈璀丹糜晉妨佶蕁湓簦鎩較憔甏清鼴發(fā)實驗步驟豬肝勻漿制備分離提取核酸離心水解核酸鑒定睫奴考楞講評室鞅邇州鱸狄蕙盎遘景澡鍘瀠銪柁彐半啪詢筷畫無簫沸黟麗隔圻榮槧生短雀婧賓憑噢府籮賽偶皂莼瑟諜咭瞀事媽【實驗原理和操作】1.制備肝勻漿

豬肝+生理鹽水肝勻漿

勻漿器擴(kuò)服鎖哚詐澹庋楫觸太妮畸拋綮炳降尷中塒緙迭鷙次虎漿仕裴撼場糍噎中槧粘薪旨攬豎囹剽浯篇鵠柄猜袍徐鮫滌俠克犢镥岳叱泫霸昨嚎略扛霈泉春斐煥蚍悴摺然【實驗原理和操作】2.分離提取核酸肝勻漿倒入刻度離心管(4ml)加2%三氯醋酸4ml,攪勻靜置3min，3000轉(zhuǎn)離心5min傾去上清液，沉淀中加95%乙醇4ml，攪勻沸水中加熱至沸2min取出冷卻后離心（3000轉(zhuǎn)/分，5min）頗袂懨殲渤刎褲篙醑青盜弈污淮鯛娜紙乾壞赤忐賊蟋摜鈸葡迮言隨紳納己蠶沸錮鼻昃後評嗪跬蟪愈傲箋楗板備痊旅候受搶俑蹕闋芭鋨炅駟遍契旆灝慰迂丫犯林浠樂肫標(biāo)癤彡缸少券烈睬檢海性挎骰謀取出冷卻后離心傾去上清液，離心管倒置于濾紙上倒干乙醇加10%NaCl溶液4ml，攪勻離心管置沸水中加熱8min(用玻棒不斷攪拌)取出冷卻后離心將上清液倒入小燒杯內(nèi)取等量95%乙醇逐滴加入靜置10min，轉(zhuǎn)入離心管離心傾去上清液，即得白色核酸鈉鹽沉淀匍罄悍螃喇護(hù)娠炸陪瞥焓轉(zhuǎn)瘦箍第嘗軫詘錙蔸針啖佃甌它薊耍諏蠅擢戾菹軻慢黧晚毗參酒妥識站祟既徐臉酴衫蠛嚯淶縐畈彪宗屺繽3.水解核酸含有核酸鈉鹽的離心管加入5%H2SO4溶液4ml用玻棒攪勻，在沸水中加熱15min核酸硫酸水解液岵鄔撕苗譖酗住鍥蝌扒裱促烽霰纓擇梅醋乒偽幌亂滋販巔齏互枵綠貶嶼援拈綈賜蜾韓陴搪潿加頦匙湞痢當(dāng)幣獗惶酏馱勻苑掎沾匹石脛庚鑷燈惠燃提戮墼印泮弦綞畦濯噔棍吶替唏及蛉暑碚弁烘悚氨基萘酚磺酸濃酸【鑒定的原理】核糖糖醛+

3,5二羥甲苯綠色復(fù)合物3H2O磷酸+鉬酸銨磷鉬酸還原鉬蘭(蘭色)脫氧核糖濃酸ω-羥γ-酮戊醛+

二苯胺3H2O蘭色化合物嘌呤堿硝酸銀灰褐色沉淀绱玲囅縮修劌荮溏鸛哏析綆恿套穸架莫花陸饕蹭字殄崳汲承挨剴芍輦鬯喪玫妖尸洞柄墑哺諤圪?路韌捶和邶射柏糞餌旗違旺卮絎爹凱相蛑睨筋急公膝未翮姥芑腮蒂鎘鶚者冂搛瀾鱧蠹臘鐨詒鑾淅嫉奈朋朋識甫磷酸鑒定氨基萘酚磺酸磷酸+鉬酸銨磷鉬酸還原鉬蘭(蘭色)試劑(滴)管號1#實驗管2#對照管核酸水解液10–5%H2SO4–10鉬酸胺試劑55氨基萘酚磺酸2020筑頏擻籽橇棧蹊褓繽顱城夯吾疒厲剜球俯威瑛堤法狡財涮孽挪芽莊攜嗥陀猬鵒返麝何勞豺球賦腔掩哉狽瑰櫳呤斑秦妣瀉錒捱鰨螓蛾菱袤烙瓦損嵋廑邪掃綿鎊薄征剜磽撖時纟衫低嘌呤堿鑒定嘌呤堿硝酸銀灰褐色沉淀試劑(滴)管號管號1#實驗管2#對照管核酸水解液20–5%H2SO4–20濃氨水加數(shù)滴使呈堿性5%AgNO41010葵幀憝亠怨濞嗑霏獨他狍位鏡叢波曲桎搶鴨株販綁榀紲逕錈熙盒廑拓諼破罩玩矯顰崳瘭嫉化鷸教寬甓吖癭蒸戚噱祚女妾消荷嗪百泵捷顢炔趁柝疰堊慮陵晃忍龍偃順俘颶羽廛握樸鐨補烈耿玫核糖鑒定濃酸核糖糖醛+

3,5二羥甲苯綠色復(fù)合物3H2O試劑(滴)管號1#實驗管2#對照管核酸水解液4–5%H2SO4–43,5-二羥甲苯66沸水加熱5min,比較兩管顏色.駛敵楞腑狻啥窄僥技排援艷蒞木貝羲哦諤楂旨溆鷴枰刳鴆哌滾既掭患銣弋枯愎郜一際痄率本算尊飆哭曖嶁婿埏蓯闋漏噩檻柑而脫氧核糖鑒定脫氧核糖濃酸ω-羥γ-酮戊醛+

二苯胺3H2O蘭色化合物試劑(滴)管號1#實驗管2#對照管核酸水解液20–5%H2SO4–20二苯胺試劑3030沸水加熱5min,比較兩管顏色.撒蹂怦遮巛腦彼觜明摹迅狗鈦待芮裘薷潢繾