分子生物學(xué)實驗備考整理

分子生物學(xué)實驗備考整理使用說明：根據(jù)學(xué)長留下的資料以及鯨魚的備考10題整合，并加入了某老師考前復(fù)習(xí)提及的內(nèi)容，錯誤之處，還請?zhí)岢?。楊琳?015.4.26實驗一血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳原理：血清蛋白的pI都在7.5以下，在pH8.6的巴比妥緩沖液中以負(fù)離子的形式存在，分子大小，形狀也各有差異，所以在電場作用下，可在醋酸纖維薄膜上分離成A、α1、α2、β、γ五條區(qū)帶。電泳結(jié)束后，將醋酸纖維薄膜置于染色液，使蛋白質(zhì)固定并染色，再脫色結(jié)果：A、α1、α2、β、γ思考題：什么方法可以證明醋酸纖維薄膜有無電滲作用？答：在充分浸泡巴比妥容顏的醋酸纖維薄膜上點樣有顏色不帶電荷的染色劑，再通電進(jìn)行電泳。若染色劑也隨之運動則有電滲作用。實驗二聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳-1分離蛋白質(zhì)原理：利用兩性電解質(zhì)載體在電場中構(gòu)成的連續(xù)pH梯度，使蛋白質(zhì)在通以直流電時聚焦在與其等電點相同的ph位置上，是等電點不同的蛋白質(zhì)泳動后形成位置不同的區(qū)帶得到分離。與聚丙烯酰胺凝膠電泳-2的異同：同皆為電泳，可用于物質(zhì)的分離與鑒定異2利用蛋白質(zhì)分子大小形狀的差異進(jìn)行分離，1利用的是兩性電解質(zhì)形成的光滑pH使蛋白質(zhì)停留在與其pI相等的位置上進(jìn)行分離；2有擴散的作用，1無擴散作用，因而物質(zhì)更集中，分辨率高；電泳時間加長，2電泳效果會變差，1可使同一蛋白區(qū)帶更狹窄，利于分辨。Ampholine：在直流電場作用下，能從正極到負(fù)極形成一個pH逐漸升高的平滑連續(xù)而且穩(wěn)定的pH梯度，從而在電泳中實現(xiàn)等電點不同的物質(zhì)的分離；AP：引發(fā)凝膠的聚合；TEMED：加速凝膠的聚合。實驗四免疫電泳和對流免疫電泳原理：免疫電泳是將電泳與雙向瓊脂擴散相結(jié)合的一種抗原分析方法。首先根據(jù)抗原中各種蛋白質(zhì)組分的電荷和分子量大小的不同，在電場作用下有不同的遷移率，從而可將抗原混合物中的各種不同組分分開，然后使其與特異性抗體進(jìn)行雙向擴散，發(fā)生免疫學(xué)沉淀反應(yīng)。對流免疫電泳是電泳技術(shù)與雙向瓊脂擴散技術(shù)相融合而形成的一種定向加速的凝膠內(nèi)免疫沉淀反應(yīng)。與雙向瓊脂擴散技術(shù)中抗原與抗體分別向四周自由擴散不同，對流免疫電泳在凝膠中加一直流電場，抗原和抗體受到電泳和電滲兩種力量的綜合作用而向某一方向定向加速移動，因此可以提高靈敏度，明顯縮短反應(yīng)時間。實驗五凝膠柱層析分離鑒定蛋白質(zhì)原理：利用交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50的凝膠過濾作用，將脲酶和胰島素分開，以Folin-Denis反應(yīng)檢查流出液中的蛋白質(zhì)。此反應(yīng)主要靠蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸與含磷鉬鎢酸的酚試劑生成藍(lán)色鉬藍(lán)，藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比關(guān)系。以納氏試劑檢查脲酶活性，此反應(yīng)是先將脲酶流出液分解尿素產(chǎn)生胺，而氨可與納氏試劑作用生成黃色的碘代雙汞胺。脲酶試劑：分子篩層析結(jié)果：先分離出脲酶，再分離出胰島素，出現(xiàn)兩個峰值實驗六DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析原理：聚酰胺薄膜層析是一類較特殊的吸附分配層析。混合物隨流動相通過聚酰胺薄膜時，由于被分離的物質(zhì)與聚酰胺薄膜上的酰胺基團(tuán)形成氫鍵，各種物質(zhì)形成氫鍵能力強弱不同，決定了吸附力的差異，吸附力強展層速度較慢，吸附力弱展層速度較快，同時展層溶劑與被分離物質(zhì)在聚酰胺粒子表面競爭形成氫鍵，選擇適當(dāng)?shù)恼箤尤軇?，使被分離物質(zhì)在溶劑與聚酰胺薄膜表面之間分配系數(shù)產(chǎn)生最大差異。一般講，易溶于展層劑的所受到的動力作用大，展層速度塊，反之速度就慢。通過各物質(zhì)的吸附力和分配系數(shù)不同，使得被分離的物質(zhì)在聚酰胺薄膜層析中得到分離。聚酰胺薄膜：由于分離物質(zhì)和展層劑的不同，其與聚酰胺薄膜上的酰胺基團(tuán)競爭形成氫鍵的能力也不同，從而可以利用其泳動速度差異，實現(xiàn)不同種物質(zhì)的分離。結(jié)果：聚酰胺薄膜上出現(xiàn)9～10個點。思考題：可否用本法分離核苷和核苷酸，為何？答：可以。核苷酸含有磷酸，極性較強，與吸附劑形成氫鍵的能力更高，故可分離。*比較雙向聚丙烯酰胺薄膜層析-1和凝膠柱層析-2同都是層析方法，可用于分離物質(zhì)；固定相均為固體，流動相均為液體；與分離物質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)，分離后可鑒定。異1屬于特殊的吸附分配層析，2屬于分子篩層析；1通過熒光觀察判斷分離物質(zhì)，2通過收集液的顯色反應(yīng)；1原理與分離物質(zhì)與聚丙烯酰胺薄膜形成氫鍵有關(guān)，2利用分子顆粒大小有關(guān)。實驗十小鼠脾單個核細(xì)胞的分離-密度梯度離心法原理：本次實驗根據(jù)顆粒沉降原理，將不同密度的小鼠脾臟細(xì)胞置于淋巴細(xì)胞分離液上進(jìn)行水平式離心，使單個核細(xì)胞在其沉降運動中位于分離液潔面上；達(dá)到分離小鼠脾單個核細(xì)胞的目的。已知小鼠淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的密度約為1.088，而紅細(xì)胞與粒細(xì)胞的密度均大于1.088。因此，用密度為1.088±0.001的淋巴細(xì)胞分離液通過密度梯度離心方法，可從小鼠脾臟細(xì)胞分離得到單個核細(xì)胞。而分離人單個核細(xì)胞的淋巴細(xì)胞分離液密度為1.077±0.001.思考題1：用Ficoll-Hypaque分層液分離淋巴細(xì)胞的原理是？得到的都是淋巴細(xì)胞？答：顆粒沉降原理。密度梯度離心使血液中各組分按不同密度重新分布。思考題2：設(shè)計實驗從小鼠脾臟細(xì)胞中分離得到CD4+T細(xì)胞答：免疫磁珠細(xì)胞分選法。CD4+T細(xì)胞與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，非CD4+T細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。實驗十三蛋白質(zhì)定量測定方法-標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量原理：雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物，在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物，此反應(yīng)即為雙縮脲反應(yīng)。含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都具有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)含有多個肽鍵，在堿性溶液中能與銅離子絡(luò)合成紫紅色化合物。其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，可以用比色法進(jìn)行鑒定。其他蛋白質(zhì)含量測定法：微量凱氏定氮法，F(xiàn)olin-酚試劑法，紫外吸收法，考馬斯亮藍(lán)法，BCA比色法，標(biāo)準(zhǔn)管法。實驗十五PCR一、檢測β-actin基因原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的情況下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段DNA片段來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此為起點，沿模板5’→3’方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。而新合成的鏈又可作為下一輪反應(yīng)的模板，如此循環(huán)往復(fù)，每循環(huán)一次，DNA分子數(shù)即按指數(shù)倍增（2n）。試劑作用：DNA樣品：提供DNA合成的模板引物：提供3’-OH末端，特異性擴增，界定擴增范圍，啟動DNA雙鏈的合成4種dNTP：雙鏈合成的原料TaqDNA聚合酶：5’→3’聚合，3’→5’內(nèi)切其他試劑：Mg2+：Taq酶活性中心需要Tris-HCl：提供最適pH:6.8~7.8，保持酶的活性并幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)KCl：促進(jìn)引物退火（使引物加到DNA鏈上）明膠：穩(wěn)定酶的作用防污染措施：1）劃分操作試驗區(qū)，并保持特定秩序2）使用一次性手套口罩帽子3）建立小包裝試劑和一次性實驗用品，放于冰箱指定區(qū)域4）打開試劑時短暫離心5）建立適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ?）改進(jìn)實驗操作二、瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段原理：在pH8.0-8.3的緩沖液中，核酸分子帶負(fù)電荷，向正極移動。由于不同大小和構(gòu)象的核酸分子電荷密度大致相同（忽略堿基上的部分電荷，每個核苷酸殘基都帶二個負(fù)電荷），因此在自由泳動時，各種核酸分子的遷移率相似，無法分開。然而，在濃度適當(dāng)?shù)沫傊悄z中，由于分子篩效應(yīng)，使大小和構(gòu)象不同的核酸遷移率出現(xiàn)差異，從而把它們分開。染色劑：溴乙錠（吖啶橙）結(jié)果：在紫外燈下可以看見220bp的熒光帶出現(xiàn)在溴酚藍(lán)的后面。DNA片段的熒光強弱由DNA含量決定，而DNA的遷移率反映了DNA片段的大小。思考題：遷移率取決于哪些條件？答：分子大小、高級結(jié)構(gòu)、膠濃度、電場強度實驗十六Trizol法抽提總RNA思考題：如何有效防止RNA酶對RNA的降解？答：實驗中必須戴一次性口罩手套；250℃烘培器皿4h；除含Tris試劑之外的試劑用DEPC處理；使用特異性RNA酶抑制劑思考題2：RNA能否用于后續(xù)實驗的常用鑒定方法。答：波長260/280光吸收比值，1.8-2.0之間純；電泳，紫外光激發(fā)下兩條帶若清晰并且28s是18s的兩倍以上，純實驗十九雙向瓊脂擴散試驗原理：雙向免疫擴散試驗是將抗原抗體分別加入瓊脂凝膠板上的小孔中，使兩者相互自由擴散，經(jīng)一定時間后，若特異性結(jié)合，即在比例適當(dāng)處形成可見的白色沉淀線。根據(jù)沉淀線的位置、數(shù)量、形狀以及對比各沉淀線間的關(guān)系，對抗原或抗體做定性分析。實驗二十ELISA—雙抗體夾心法原理：將可溶性的抗原或抗體吸附到固相載體上，并保持其免疫活性，使之結(jié)合并吸附抗體或抗原，通過洗滌去除未結(jié)合成分，再與酶標(biāo)記的抗體或抗原結(jié)合，并保留酶的活性，然后加入酶反應(yīng)的底物，后者被催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)反應(yīng)顏色的深淺進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量的方法。操作過程：①用一直抗體包被固相載體；②加入受檢的標(biāo)本（含待測抗原），使抗原與固相上的抗體結(jié)合；③加入以辣根過氧化物酶標(biāo)記的已知抗體，使之與抗原結(jié)合。標(biāo)記的酶可催化底物（四甲基聯(lián)苯胺）起顯色反應(yīng)，從而指示特異性抗原抗體反應(yīng)的存在。注意事項：①對倍稀釋抗原混勻時不要產(chǎn)生太多氣泡；②酶標(biāo)板要洗滌干凈不要交叉污染；③加樣時從最低稀釋度逐一加至最高稀釋度。實驗二十一細(xì)胞膜表面抗原檢測—補體依賴的微量淋巴細(xì)胞毒試驗思考題1：抗體與淋巴細(xì)胞表面的膜抗原特異性結(jié)合后，如何導(dǎo)致靶細(xì)胞的溶解死亡？答：與補體結(jié)合后通過一系列反應(yīng)產(chǎn)生C5轉(zhuǎn)化酶，裂解C5，得到C5b，后與C6C7C8n個C9結(jié)合形成MAC，在細(xì)胞膜上穿孔，導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解死亡。思考題2：何種技術(shù)鑒別死活細(xì)胞？答：1、染色排除法：不容易穿過活細(xì)胞的酸性染料滲入死亡細(xì)胞內(nèi)使其著色；2、熒光排除法石蠟油：密封細(xì)胞反應(yīng)板，防止污染，利于孵育；抗淋巴血清：作為抗體提供補體結(jié)合位點與補體結(jié)合，使其活化形成MAC；細(xì)胞培養(yǎng)液：作為抗體的陰性對照；補體：與抗體的補體結(jié)合位點結(jié)合，活化形成MAC，檢測是否有特異性抗原；錐藍(lán)：使死細(xì)胞著色，通過光學(xué)顯微鏡觀察，可以測得死細(xì)胞百分率。實驗二十五蟾蜍血細(xì)胞的體外融合PEG：具有強烈的吸水和凝聚沉淀蛋白質(zhì)的作用，可改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點處脂類分子發(fā)生分散和重組，引起細(xì)胞融合。實驗二十七動物染色體的制備秋水仙素：抑制紡錘體形成，使細(xì)胞周期停留在中期，便于觀察。KCl低滲溶液：使得細(xì)胞膨脹，利于中期染色體的觀察。綜合實驗EDTA：絡(luò)合二價金屬離子，當(dāng)Mg2+被絡(luò)合后，細(xì)胞內(nèi)釋放出來的DNA酶被抑制，避免DNA的降解，同時金屬離子絡(luò)合后，細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，有利于膜的裂解；SDS：使蛋白質(zhì)變性，能破壞膜蛋白的構(gòu)象，使膜裂解，又能使核蛋白中的核酸與蛋白質(zhì)解離，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。其他：兩種核酸提取的基