紅蟹ropomeosin肌肉中變應(yīng)原基因的克隆及免疫學(xué)特性鑒定

紅蟹ropomeosin肌肉中變應(yīng)原基因的克隆及免疫學(xué)特性鑒定

隨著生活水平的提高，人們對(duì)水（如蝦、螃蟹、魚等）的消費(fèi)越來(lái)越頻繁，導(dǎo)致過(guò)敏疾病的數(shù)量也在增加。據(jù)伍秋容研究發(fā)現(xiàn),在4歲以后,引起患者過(guò)敏的食物變應(yīng)原逐漸以蝦、蟹為主。其臨床表現(xiàn)主要有惡心、嘔吐、腹痛、腹脹、腹瀉、皮疹、鼻炎、哮喘等,嚴(yán)重的可導(dǎo)致休克甚至危及生命。紅星梭子蟹(Portunussanguinolentus)是我國(guó)南方食用蟹之一,屬于梭子蟹科、梭子蟹屬,在我國(guó)主要分布在南海一帶,在日本、夏威夷、菲律賓等環(huán)太平洋沿岸的暖水區(qū)亦有分布,是我國(guó)南方特別是廣東地區(qū)最常食用的水產(chǎn)食品之一。趙綺華等運(yùn)用免疫印跡的方法分析了花蟹(Portunuspelogicus)的主要致敏成分為分子量74.4kD和48.7kD的兩個(gè)蛋白。但目前國(guó)內(nèi)有關(guān)蟹變應(yīng)原的分子生物學(xué)研究尚未見報(bào)道。本研究利用簡(jiǎn)并引物從紅星梭子蟹蟹肉中克隆獲得一個(gè)Tropomyosin基因,并將該基因在大腸桿菌中表達(dá),獲得有活性的重組蟹Tropomyosin,并用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了鑒定,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料和方法1.1原核表達(dá)載體pet-28a紅星梭子蟹(Portunussanguinolentus)購(gòu)自深圳市南山菜市場(chǎng)。RNA提取試劑盒購(gòu)于Qiagen公司;AMVFirstStrandcDNASynthesisKit購(gòu)于BBI公司;pMD18-TVector、限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI、T4DNA連接酶均購(gòu)于Takara公司。原核表達(dá)載體pET-28a購(gòu)自Novagen公司。ProteoExtractAll-in-OneTrypsinDigestionKit購(gòu)自英韋創(chuàng)津公司。血清由深圳市第一人民醫(yī)院提供:選擇臨床上有吃蟹過(guò)敏史的患者,其血清經(jīng)法碼西亞CAP過(guò)敏原自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè),收集蟹特異性IgE陽(yáng)性且反應(yīng)達(dá)2級(jí)或2級(jí)以上的患者血清12人份,另取健康(無(wú)過(guò)敏病史)人血清5人份,分別分裝后放-80℃低溫保存?zhèn)溆谩?.2方法1.2.1篩選保守區(qū)域從SWISS-PROT、TrEMBL以及NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)下載到17個(gè)動(dòng)物性變應(yīng)原Tropomyosin的核酸序列。利用CLUSTALW程序?qū)@些序列進(jìn)行同源性比對(duì),確定其保守區(qū)域。根據(jù)保守區(qū)域序列,設(shè)計(jì)并合成簡(jiǎn)并引物(由上海生工合成):Trop5a:ATGGA(C/G)GC(C/A)ATCAAGAAGAAGATGC;Trop3b:TTA(G/A)TAGCCAG(T/A)(C/A)AGTTCGC。1.2.2逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈Tropomyosin基因的克隆與測(cè)序從新鮮蟹肉中提取總RNA,提取過(guò)程按照Qiagen公司試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用AMVFirstStrandcDNASynthesisKit,以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈。以RT產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),結(jié)束反應(yīng)后將目的條帶連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后將陽(yáng)性菌落進(jìn)行序列測(cè)定(由上海生工完成)。1.2.3序列分析與同源性比對(duì)1.2.4pcr擴(kuò)增pet-28a表達(dá)載體的制備在蟹TropomyosincDNA的5′和3′末端通過(guò)PCR反應(yīng)分別引入NdeI和XhoI酶切位點(diǎn),PCR引物序列如下:C5:GGACATATGGAGGCCATCAAG(劃線部分為NdeI酶切位點(diǎn))和C3:GAGCTCGAGTTAATAGCCAGTCAG(劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn))。回收PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上經(jīng)測(cè)序無(wú)誤后,提取質(zhì)粒進(jìn)行NdeI和Xho1雙酶切,暴露出基因片段兩端的NdeI和Xho1黏端,與同樣經(jīng)過(guò)NdeI和Xho1雙酶切的pET-28a表達(dá)載體,在T4DNA連接酶作用下16℃連接過(guò)夜。挑取可疑陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。1.2.5重組蛋白的純化參照Novagen公司的pETSystemManual(11thEdition)進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),Ni2+親和層析柱進(jìn)行純化,用40mmol/L咪唑和200mmol/L咪唑洗脫,收集洗脫峰,SDS電泳檢測(cè)后對(duì)含目的蛋白洗脫組分進(jìn)行透析并凍干保存。1.2.6陽(yáng)性混合血清和陽(yáng)性混合血清血清學(xué)印像檢測(cè)以重組表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS電泳,經(jīng)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,用蟹過(guò)敏性患者陽(yáng)性混合血清為一抗,生物素標(biāo)記的羊抗人IgE為二抗,用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素對(duì)陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)一步放大,以3,3′5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物進(jìn)行顯色,進(jìn)行Western-blot印跡檢測(cè)。1.2.7質(zhì)量分析的確定2結(jié)果2.1rt-pcr產(chǎn)物的檢測(cè)提取的蟹肉總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,然后以為此為模板,用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(圖1),在855bp左右有一亮帶,大小與理論預(yù)計(jì)值相符。回收RT-PCR產(chǎn)物并與pMD18-TVector連接后轉(zhuǎn)化E.coliTop10。挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果用NCBI中的BLAST程序進(jìn)行序列同源性比較,發(fā)現(xiàn)它們與GenBank中已知的蝦、蟹、螨、蟑螂等的原肌球蛋白基因(Tropomyosin)序列同源性較高。2.2強(qiáng)化同源性分析克隆得到的蟹Tropomyosin基因(圖2)由855個(gè)堿基組成,其中開放閱讀框?yàn)?55個(gè)堿基(含終止密碼子),編碼285個(gè)氨基酸。經(jīng)計(jì)算分析,推測(cè)該蛋白的等電點(diǎn)為4.71,理論分子量為32.8kD。利用EMBL-EBI的CLUSTALW(1.82)程序進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì),結(jié)果顯示由紅星梭子蟹Tropomyosin基因推導(dǎo)的氨基酸序列與Leung,etal.克隆得到紅蟹Tropomyosin和Mykles,etal.克隆得到的美洲螯龍蝦Tropomyosin的同源性較高,均為97%,而且與其他已知?jiǎng)游镄苑鹤儜?yīng)原Tropomyosin的同源性也較高(圖3),如與中國(guó)龍蝦和刀額新對(duì)蝦泛變應(yīng)原Tropomyosin的同源性均為92%;與塵螨和美洲大蠊的同源性分別為92%和83%。由此可認(rèn)定該基因?yàn)樾稵ropomyosin基因,將其提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為EF143836。根據(jù)變應(yīng)原命名法則將該基因推導(dǎo)的蛋白暫命名為Pors1。2.3tropomiolin基因片段鑒定提取經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的重組表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行NdeI和XhoI雙酶切鑒定(圖4),載體片段約為5000bp,插入的蟹Tropomyosin基因片段為855bp,同預(yù)期的大小一致。DNA序列測(cè)定結(jié)果顯示克隆的片段為Pors1的完整編碼框(包括起始密碼子和終止密碼子)。2.4sds-東南角電泳分析含有pET28a-Pors1的表達(dá)菌株BL21(DE3)經(jīng)終濃度為1mmol/LIPTG誘導(dǎo)過(guò)夜獲得重組蛋白,SDS電泳分析顯示在約38kD處有外源蛋白表達(dá)條帶出現(xiàn)(圖5),比理論分子量(32.8kD)稍大,與預(yù)期結(jié)果基本相符。采用Ni柱親和層析的方法純化重組蛋白,收集各峰峰液,進(jìn)行SDS分析后發(fā)現(xiàn),用200mmol/L咪唑洗脫的峰中含有大量高純度目的蛋白。2.5血清蛋白的ige結(jié)合活性測(cè)定結(jié)果用12個(gè)蟹過(guò)敏患者的混合血清作為一抗進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn),結(jié)果顯示在約38kD處有一明顯的識(shí)別條帶(圖6),而陰性混合血清組則沒有,說(shuō)明Pors1重組蛋白具有良好的IgE結(jié)合活性。2.6重組蛋白的同源性根據(jù)MALDI-TOF-MS獲得的肽指紋圖譜(PMF,圖7)在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì),重組蛋白與Chaf1(Q9N2R3)有很高的同源性,多肽覆蓋率達(dá)到60%(圖8)。這證明目的條帶確為大腸桿菌表達(dá)的蟹Tropomyosin蛋白。3tropomiin基因家族在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用蟹是最常見的致敏水產(chǎn)品之一,其品種繁多,如雪蟹、梭子蟹、青蟹等。早在1982年,美國(guó)的職業(yè)安全與健康學(xué)會(huì)(NIOSH)就發(fā)表了關(guān)于雪蟹在加工過(guò)程中能引發(fā)工人職業(yè)性哮喘的研究報(bào)告。該IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)在隨后的許多報(bào)道中得到了證實(shí)。Leung,etal.第一次報(bào)道了紅蟹(Charybdisferiatus)的主要變應(yīng)原為34kD蛋白,其氨基酸序列與蝦原肌球蛋白(Mete1)變應(yīng)原有極高的同源性。這引起了科學(xué)家們的極大興趣。據(jù)資料顯示,引發(fā)食物性過(guò)敏反應(yīng)的食用性的甲殼類(如蝦、蟹、龍蝦、螯蝦等),其主要變應(yīng)原是肌肉蛋白原肌球蛋白(Tropomyosin)。它的分子量在35—38kD左右,由兩個(gè)多肽鏈組成,含一個(gè)α-螺旋和一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu);該蛋白質(zhì)家族具有高度保守性,并含多種亞型。越來(lái)越多的資料顯示,原肌球蛋白在甲殼類和軟件動(dòng)物中具有高度保守性,并且是主要的交叉變應(yīng)原。目前直接和間接的證據(jù)都表明,引起相似臨床癥狀的不同種類的甲殼動(dòng)物(蝦、蟹、龍蝦)和其他一些食用性無(wú)脊椎動(dòng)物(烏賊、章魚)的Tropomyosin都具有IgE抗體的交叉反應(yīng)性。而且,正是由于Tropomyosin的這種特殊致敏性,研究者發(fā)現(xiàn)屋塵螨變應(yīng)原與海產(chǎn)品變應(yīng)原之間存在一定的聯(lián)系,特別是在利用塵螨粗提液進(jìn)行免疫治療的時(shí)候。最近一項(xiàng)研究表明,暴露在屋塵螨Tropomyosin下可以導(dǎo)致患者對(duì)蝦Tropomyosin過(guò)敏。因此有必要對(duì)海產(chǎn)的Tropomyosin變應(yīng)原進(jìn)行研究。本研究利用上述Tropomyosin特殊的保守性,通過(guò)生物信息學(xué)分析了多種甲殼類和軟體動(dòng)物的變應(yīng)原Tropomyosin基因序列,根據(jù)其高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,RT-PCR成功克隆出紅星梭子蟹Tropomyosin變應(yīng)原的完整基因。序列分析結(jié)果顯示該基因與已知的蝦、塵螨、蟑螂等變應(yīng)原Tropomyosin基因有很高的同源性(>80%),如與紅蟹Chaf1和美洲螯龍蝦Homa1的同源性均為97%;與中國(guó)龍蝦Pans1和刀額新對(duì)蝦Mete1的同源性均為92%。目的基因通過(guò)pET-28a載體在原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高效表達(dá),經(jīng)Ni2+親和層析柱純化后重組蛋白純度達(dá)96%以上。Western-blotting檢測(cè)結(jié)果顯示純化后的重組蛋白具有良好的免疫學(xué)活性,MALD