蛋白質(zhì)分離純化與鑒定技術(shù)

蛋白質(zhì)分離純化與鑒定技術(shù)題記：上世紀(jì)七十年代，蛋白純化一度受到冷落的現(xiàn)象將一去不復(fù)返了報告內(nèi)容蛋白質(zhì)分離純化的常用技術(shù)手段分離純化中蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性及其對策蛋白質(zhì)的純度及活性測定有關(guān)蛋白質(zhì)純化的整體思考應(yīng)用舉例蛋白質(zhì)分離純化的

常用技術(shù)手段發(fā)酵液預(yù)處理細胞分離細胞破碎碎片分離產(chǎn)品粗純胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物加熱、調(diào)PH、絮凝離心、膜分離珠磨法、高壓勻漿、超聲法、酶解法離心、雙水相萃取、膜分離鹽析、層析、膜分離產(chǎn)品精純層析、膜分離成品制作濃縮、干燥、無菌過濾、成型常用純化技術(shù)從上表可以總結(jié)出，蛋白分離純化中的常用技術(shù)如下：絮凝、膜分離、細胞破碎、雙水相萃取、鹽析、柱層析、離心等。絮凝技術(shù)我國工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵一般仍采用粗料發(fā)酵（料液中含豆餅粉、玉米粉等），發(fā)酵液含大量殘留培養(yǎng)基，造成固液分離困難。絮凝技術(shù)可較好地解決這一問題。絮凝技術(shù)：通過在發(fā)酵液中加入大分子物質(zhì)（殼聚糖）和鹽類，從而改變固體粒子的物理特性，使之聚合在一起形成更大的粒子而沉降，這一技術(shù)稱為絮凝技術(shù)。缺點：影響因素多，不同批次的發(fā)酵液組成及發(fā)酵時間對絮凝效果均有較大影響，放大困難。前途：若使用精料發(fā)酵，則可放棄該技術(shù)。膜分離技術(shù)定義：膜分離技術(shù)是用半透膜作為選擇障礙層，允許某些組分透過而保留混合物中的其它組分，從而達到分離目的的技術(shù)。它具有設(shè)備簡單、操作方便、無相變、無化學(xué)變化、處理效率高和省能等優(yōu)點，已作為一種單元操作而受到人們的重視。名稱粒子大小分離原理粒子過濾>10um篩分原理微濾0.05—10um超濾1—1000kD受分子大小、分子構(gòu)象、攜帶電荷等多種因素影響納濾100—1000反滲透<100的有機物透析小分子有機物和離子電滲析離子、氨基酸滲透蒸發(fā)<100的有機物透析：它基于分子大小、分子構(gòu)象與電荷、以濃度梯度為驅(qū)動力，通過水與小分子物質(zhì)擴散達到分離濃縮的目的。截留分子量的確定：選擇截留率在90%那點對應(yīng)的分子量作為該膜的截留分子量。由于各個廠家所用的標(biāo)準(zhǔn)品不同，所以很難把不同來源的膜的截留分子量作統(tǒng)一比較。膜分離的優(yōu)缺點優(yōu)點：具有設(shè)備簡單、操作方便、無相變、無化學(xué)變化、處理效率高和省能等優(yōu)點。缺點：1：分辨率不高，很難把分子量很近的分子分開。一般要求兩個分子的分子量相差10倍以上。2：膜污染膜污染：分離中的物質(zhì)通過化學(xué)和機械作用，引起膜表面或膜孔內(nèi)吸附、沉積造成膜孔徑變小或堵塞，使膜產(chǎn)生透過量與分離特性不可逆變化的現(xiàn)象。膜一旦接觸待分離的物質(zhì)，膜污染就已開始。膜污染現(xiàn)象限制了膜的推廣應(yīng)用。細胞破碎常用方法物理法：珠磨法、高壓勻漿法和超聲破碎法等?；瘜W(xué)法：酶溶法、螯合劑法、溶劑法等。珠磨破碎細胞法利用珠磨機內(nèi)大量的玻璃珠在攪拌槳的作用下通過碰撞、剪切等作用撕破或磨碎細胞以達到胞內(nèi)產(chǎn)物釋放的方法。珠磨機物料的出口處設(shè)有夾縫或篩孔板用以截留玻璃珠，從而實現(xiàn)連續(xù)操作。物料入口物料出口優(yōu)點：處理量大，與高壓勻漿法比，更容易進行溫度控制。缺點：樣品有一定程度的損耗，破碎程度較難控制。高壓勻漿破碎細胞法利用高壓破碎細胞，其原理為：從高壓室（幾百個大氣壓）壓出的細胞懸液經(jīng)過閥坐的中心孔道從閥坐和閥桿之間的小環(huán)隙中噴出，速度可達每秒幾百米。這種高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列的過程中經(jīng)歷了高速造成的剪切、碰撞、以及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞的破碎。閥坐撞擊環(huán)閥桿優(yōu)點：處理量大、設(shè)備簡單。缺點：破碎條件劇烈，易造成蛋白失活，噪音大。超聲波破碎細胞法原理：通過空化作用破碎細胞。優(yōu)點：設(shè)備簡單，可快速處理小批量樣品。缺點：不適宜處理大量樣品，溫度不易控制，超聲產(chǎn)生的自由基可導(dǎo)致某些蛋白失活。（思考）雙水相萃取萃?。豪梦镔|(zhì)在兩種互不混溶的溶劑中的分配差異進行分離的技術(shù)。有機溶劑萃?。河袡C溶劑從水中萃取物質(zhì)。反萃取：水溶液從有機溶劑中萃取物質(zhì)。以上萃取的共同點是：萃取反應(yīng)中的兩相性質(zhì)差異顯著，表面張力大，易導(dǎo)致物質(zhì)失活。雙水相萃?。阂騼煞N水溶性聚合物的水溶液或一種水溶性聚合物的水溶液與鹽液混合時的不相容性而形成有明顯界面的兩相系統(tǒng)。優(yōu)點：萃取條件溫和[兩相均含有大量水（80%以上）界面張力小]；生物相容性好，有時還有穩(wěn)定作用；分配系數(shù)可控（相系統(tǒng)組成、聚合物修飾）；易于放大（幾百上千倍）。缺點：系統(tǒng)中較高濃度的水溶性聚合物和鹽會帶到產(chǎn)物中，去除需要輔助方法。應(yīng)用舉例聚乙二醇/葡聚糖系統(tǒng)：9%PEG4000/1.25%DEX1500,PH7.8聚乙二醇/鹽系統(tǒng)：聚乙二醇/磷酸鉀、磷酸鈉、硫酸銨、硫酸鈉、琥鉑酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉。真核細胞表達的beta-IFN經(jīng)雙水相萃取，提純了630倍?？赡艿膽?yīng)用超聲上清→PEG/鹽系統(tǒng)→疏水層析鹽 析常用的為硫酸銨沉淀，實際上很多種鹽對蛋白均有沉淀作用，如硫酸鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等。上述鹽類對蛋白的沉淀能力，對系統(tǒng)PH值的影響均有不同，可根據(jù)實際情況進行選擇。色譜—層析正相色譜反相色譜色譜柱基本理論VR1VR2W1W2W1+W22(VR2—VR1)RS=RS1.5時兩個組分才能完全分開分辨率相關(guān)參數(shù)上式中N代表理論塔板數(shù)，由公式可以看出，RS隨N值的增大而增大，N值增大兩倍，RS增加1.41倍因此理論塔板數(shù)越高，分辨率越高。塔板理論最早由化工專家提出，認(rèn)為可以將一根色譜柱看作是一根精餾柱，它由許多級蒸餾的小塔板或小短柱組成。這種假想的小塔板或小短柱越小或越短，就意味著在一個精餾塔或分離柱上允許反復(fù)進行平衡的次數(shù)就越多，即具有更高的分辨率。塔板數(shù)的計算n=5.54(VR/Wh/2)2VRWh/2VR：峰高Wh/2：1/2峰高處的峰寬由公式可知，峰越尖，n值越大，柱子的分離能力越強為便于比較，一般要給出每米柱子的理論塔板數(shù)N，我們可以由N值推算出層析柱的理論塔板高度：H=1000mm/N通過進一步的數(shù)學(xué)推導(dǎo)，可以得到以下公式：H=2.48dpi其中dpi代表分離介質(zhì)微粒的直徑，由此可看出，分離填料的顆粒越細，則每米理論塔板數(shù)越高，從而每米柱長的分辨率也越高雖然分離介質(zhì)的顆粒越小，分辨率越高，但同時也造成柱子的反壓增大，流速降低，同時生產(chǎn)成本大幅增高。根據(jù)目前的研究情況預(yù)測，填料直徑的最小極限是3um左右。層析柱的分類按流動相與固定相的極性分：正相、反相按樣品在固定相與流動相之間的分配情況分：線性、非線性按分離效率分，HPLC、常規(guī)柱色譜固定相樣品濃度流動相樣品濃度線性色譜非線性色譜線性和非線性色譜線性色譜1：樣品的保留值不變2：峰形對稱3：色譜峰的峰高與濃度呈線性關(guān)系非線性色譜1：樣品的保留值可變2：峰形不對稱3：色譜峰的峰高與濃度不呈線性關(guān)系HPLC和常規(guī)柱色譜HPLC高效體積排阻層析高效離子交換層析高效疏水層析高效反相層析高效親和層析常規(guī)柱色譜體積排阻層析離子交換層析疏水層析親和層析HPLC優(yōu)點：分離效率高分離速度快可重復(fù)性強缺點：設(shè)備昂貴填料昂貴填料耐受酸堿的能力差與軟膠相比，生物相容性差常規(guī)柱色譜優(yōu)點：生物相容性好，尤其適合分離生物大分子易于裝填、易于放大其配套設(shè)備，分離介質(zhì)及在使用方面的理論和經(jīng)驗均較成熟。成本低廉缺點：柱效低，目前應(yīng)用的最小顆粒為10um分離速度慢，只能承受很小的壓力分離介質(zhì)為軟膠，在不同的PH及鹽濃度下，有溶脹或收縮的現(xiàn)象發(fā)生，影響分離效果體積排阻層析分離原理：根據(jù)分子的流體力學(xué)半徑大小進行分離。影響因素：分離介質(zhì)（疏水性、荷電情況）；樣品性質(zhì)（疏水性、荷電情況）；緩沖液組成（表面活性劑、粘度）體積排阻層析介質(zhì)的選擇分子量分離范圍3000-70000SepharoseSephadexSuperdex顆粒大小凝膠類型SELECTIONGUIDEBYTECHNICALOVERVIEW-GelFiltrationUsefulUsefulRec.FlowRate*FractionationRange(Mr)FractionationRange(Mr)PrepackedColumnsAverageParticleProduct(Proteins)(Dextrans)(ml/min)Size(μm)SuperdexPrepackedHR,PCandPEcolumnsSuperdexPeptide<ENDREF<FONT>100-7000(peptides)NA0.4-1.2***13Superdex75<ENDREF<FONT>3×1037×1045×102-3×1040.4-1.0***13Superdex200<ENDREF<FONT>1×104-6×1051×103-1×1050.4-1.0***13SuperdexprepgradeHiLoadprepackedcolumnsandlabpacksSuperdex30prepgrade<ENDREF<FONT>upto1×104NA0.3-1.734Superdex75prepgrade<ENDREF<FONT>3×103-7×1045×102-3×1040.3-1.734Superdex200prepgrade<ENDREF<FONT>1×104-6×1051×103-1×1050.3-1.734SuperosePrepackedHRandPCcolumnsSuperose12<ENDREF<FONT>1×103-3×105NA0.1-0.510Superose6<ENDREF<FONT>5×103-5×106NA0.1-0.513SuperoseprepgradeLabpacksSuperose12prepgrade<ENDREF<FONT>1×103-3×105upto3×1050.5***30Superose6prepgrade<ENDREF<FONT>5×103-5×106upto1×1060.3-0.5***30SephacrylHiPrepprepackedcolumnsandlabpacksSephacrylS-100HR<ENDREF<FONT>1×103-1×105NA0.1-1.050SephacrylS-200HR<ENDREF<FONT>5×103-2.5×1051×103-8×1040.1-1.050SephacrylS-300HR<ENDREF<FONT>1×104-1.5×1062×103-4×1050.1-1.050SephacrylS-400HR<ENDREF<FONT>2×104-8×1061×104-2×106NA50SephacrylS-500HR<ENDREF<FONT>NA4×104-2×107NA50SephacrylS-1000SF<ENDREF<FONT>NA5×105->108NA50UsefulUsefulApprox.Max.FractionationRange(Mr)FractionationRange(Mr)BedVolumeFlowRateParticleSizeRange,Product(Globularproteins)(Dextrans)ml/gDrySephadex(ml/min)*WetBead(μm)SephadexSephadexG-10<ENDREF<FONT>upto7×102upto7×1022-3

Darcy’slaw**

55-165SephadexG-15<ENDREF<FONT>upto1.5×103upto1.5×1032.5-3.5

60-180SephadexG-25Fine<ENDREF<FONT>1×103-5×1031×102-5×1034-6Darcy’slaw

35-140

Medium

85-260

Coarse170-520

Superfine17-70SephadexG-50Fine<ENDREF<FONT>1.5×103-3×1045×102-1×1049-11Darcy’slaw40-160

Medium100-300

Coarse200-610

Superfine20-80SephadexG-75<ENDREF<FONT>3×103-8×1041×103-5×10412-156.4

90-280

Superfine3×103-7×104NANA1.525-90SephadexLH-20<ENDREF<FONT><5×103NAdependsonsolventNA

NA*

Distilledwater,25°C.離子交換層析在適宜的載體上，例如纖維素、瓊脂糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠以及各種合成高聚物型凝膠上，通過酯化、醚化或氧化等化學(xué)反應(yīng)，引入具有酸性或堿性的離子基團，便可制備出各種類型的離子交換填料。離子交換層析的分類離子交換填料的選擇離子交換類型DEAEQSP凝膠類型顆粒大小CM200-600100-30040-16020-8010-20瓊脂糖含量及交聯(lián)度Sepharose6B、4B、2BSepharoseCL-6B、CL-4B、CL-2BSepharoseF.F高交聯(lián)度，剛性更強。隨著交聯(lián)度的提高，疏水性隨之增強，更易發(fā)生非特異吸附，故交聯(lián)度不能過分提高疏水層析疏水介質(zhì)的選擇配基類型高密普通凝膠類型顆粒大小影響疏