mRNA差別顯示技術(shù)

mRNA差別顯示技術(shù)生工1班楊金鑫主要內(nèi)容概述定義及原理應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)展望

高等生物大約有3~5萬個(gè)不同的基因，在每一個(gè)正常的體細(xì)胞中都含有相同的基因組拷貝，但在不同的組織細(xì)胞中僅有10%~20%的少部分基因被選擇性表達(dá)，這種選擇性表達(dá)是在發(fā)育過程中細(xì)胞分化的根本原因，是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過程的核心機(jī)制。因此，比較不同組織之間，或相同組織在不同生理?xiàng)l件下，或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因表達(dá)差異，可分離并克隆出這些特異性表達(dá)的基因。近年來，該領(lǐng)域的研究取得了很大進(jìn)展，扣除雜交（subtractivehybridization,SH）、基因芯片技術(shù)（DNAchiptechnique）、基因表達(dá)的系統(tǒng)分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)、噬菌體全套抗體庫(kù)技術(shù)(phagedisplayantibodyrepertoirelibrarytechnique)和雙向電泳技術(shù)(two-dimensionalgelelectrophoresis)先后成功地建立。一.概述基因表達(dá)調(diào)控的一種方式。指在對(duì)信號(hào)或誘導(dǎo)物做出應(yīng)答時(shí)，選擇表達(dá)不同的基因，或使基因的表達(dá)水平有所不同?；虿町惐磉_(dá)DD的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達(dá)基因強(qiáng)有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術(shù)方面做了大量改進(jìn)，使技術(shù)更適用、更簡(jiǎn)便基于RT-PCR理論，依賴于3種技術(shù)1）RT-PCR技術(shù)2）以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)3）DNA電泳技術(shù)

二.基本概念

mRNA差別顯示技術(shù)也稱為差示反轉(zhuǎn)錄PCR（DifferentialDisplayofreverseTranscriptionalPCR）簡(jiǎn)稱為ddRT-PCR。它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。目前已廣泛應(yīng)用于分離鑒定組織特異性表達(dá)的基因。

反轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。其原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。反轉(zhuǎn)錄PCRRNA指紋

RNA首先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下使RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，之后以其DNA為模板，通過以DNA指紋技術(shù)建立指紋圖譜進(jìn)行分析。DNA指紋

某些DNA序列的差異可通過限制性酶切片段長(zhǎng)度的改變反映出來，此即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)。其主要原因是由于DNA序列個(gè)別堿基的突變而引起某個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的獲得或丟失，表現(xiàn)為不同長(zhǎng)度的酶切片段．水稻品種DNA指紋基本原理

利用所有真核基因的mRNA的3’端都有一段多聚腺苷酸poly(A)尾結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，將不同來源的總mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,此cDNA合成是采用oligo(dT)12MN為引物，其中M為A,C,G中的任意一種，N為A,C,G或T中的任意一種，共有12種oligo(dT)12MN引物，其中M為錨定堿基可增大引物的Tm值，N稱為分類堿基，對(duì)反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分類。用這12種引物分別對(duì)同一總mRNA樣品進(jìn)行cDNA合成，即進(jìn)行12次不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到12種類型的cDNA，從而也將總mRNA分為12個(gè)亞群。在此基礎(chǔ)上對(duì)每一類cDNA進(jìn)行隨機(jī)引物和相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物PCR擴(kuò)增，由于擴(kuò)增的cDNA片段被放射性同位素標(biāo)記，因而利用放射自顯影技術(shù)通過對(duì)不同組織樣品的同一類cDNA的PCR選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，從而反映出不同樣品間基因的時(shí)間和空間上的組織特異性的表達(dá)。

基本原理是，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都帶有一個(gè)多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu)，即通常所說的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA為模板，以oligo(dT)為引物合成出cDNA拷貝。根據(jù)mRNA分子3’-末端序列末端結(jié)構(gòu)的分析可以看到，在這段poly(A)序列起點(diǎn)堿基之前的一個(gè)堿基，除了為A的情況之外，只能有C、G、T三種可能。根據(jù)這種序列結(jié)構(gòu)特征，P.Peng等人設(shè)計(jì)合成三種不同的下游引物，它由11個(gè)或12個(gè)連續(xù)的脫氧核苷酸加上一個(gè)3’-末端錨定脫氧核苷酸組成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，這樣每一種此類人工合成的寡核苷酸引物都將能夠把總mRNA群體的1/3分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。于是，采用這三種引物，可以將整個(gè)mRNA群體在cDNA水平上分成三個(gè)亞群體。然后用一個(gè)上游的隨機(jī)引物和與反轉(zhuǎn)錄時(shí)相同的oligo(dT)引物對(duì)這個(gè)ｃＤＮＡ亞群體進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，因?yàn)檫@個(gè)上游的引物將隨機(jī)結(jié)合在cDNA上,因此來自不同ｍＲＮＡ的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是不同的，可以在測(cè)序膠上明顯分辨開來，從而篩選出不同樣品間基因差異表達(dá)的DNA片段。5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機(jī)引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長(zhǎng)dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動(dòng)cDNA第一鏈合成不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴(kuò)增，克隆測(cè)序，同源比對(duì)隨機(jī)結(jié)合到cDNA鏈上(1)提取總RNA，在這個(gè)步驟中注意不能有DNA污染，一般用無RNA酶的DNA酶在37℃下處理30min；(2)在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以O(shè)ligoT11MN為引物(M為G、A、C中的任一種，N為A、C、G、T任一種)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；(3)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增cDNA的第一條鏈；(4)擴(kuò)增后的cDNA進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使差異表達(dá)的cDNA片段在6%