高等動植物染色質重塑研究進展

高等動植物染色質重塑研究進展

如何正確管理和維護高等動植物中多個基因的表達水平，是當前生物學中非常重要和值得研究的問題。染色表面遺傳機制（epigenianmechanim）在調節(jié)遺傳因素的時空特異性表達和沉默方面發(fā)揮著重要作用。目前，表觀遺傳篩選機制主要包括dna異甲基化、組蛋白語、ps-p取決于染色重建（pd-dem）和非編碼rna。其中，pd誘導染色重建（本文簡稱染色重建）是表觀遺傳研究領域的一個重要熱點。同時，本文描述了高等動植物干部的自我更新和分化、器官和個人體育發(fā)育以及腫瘤的形成過程。在本文中，我們討論了高等動植物干部swi和snf染色重建的異同點，并介紹了swi和snf染色重建的最新情況。1swi/snf染色質重塑復合材料的結構與基因轉錄調控ATP依賴的染色質重塑主要利用ATP釋放的能量,使得核心組蛋白八聚體在DNA鏈上滑動,改變核小體間距,或將核小體移除或滑動,或以置換組蛋白變體的方式來改變核小體的構象,使靶基因的增強子、啟動子或者DNA的復制區(qū)等暴露出來,從而調控基因的表達、轉錄、復制、重組等.染色質重塑復合體三維結構信息的獲得,對于深入探究復合體如何結合并重塑核小體進而實現(xiàn)調控基因表達的機制具有重要意義.2002年,Asturias等首先通過負染色電鏡技術進行三維重構,解析了酵母中RSC(remodelsthestructureofchromatin)染色質重塑復合體的結構.該復合體的結構由4個球狀結構域環(huán)繞,中央位置形成一個空腔.其中三個球狀結構域處于較高的位置,通過一個穩(wěn)定的連接區(qū)域與另一個處于較低空間的球狀結構域相連.復合體可以通過連接區(qū)域收緊與松懈調節(jié),形成緊密式和開放式兩種構象.在開放構象狀態(tài)下,復合體形成足夠容納核小體的C型結構.隨后,Smith和Leschzier等相繼對酵母SWI/SNF(switchingdefective/sucrosenon-fermenting)染色質重塑復合體和人類PBAF(polybromoassociatedBAF)染色質重塑復合體進行了三維結構分析,其中人PBAF復合體的結構與酵母的RSC復合體結構類似,形成可以容納核小體的C狀結構.2011年,Brown等通過體內實驗證實了SWI/SNF染色質重塑復合體轉錄激活酵母PHO8啟動子區(qū),更傾向于通過解裝核小體,而不是通過使核小體滑動,使得啟動子區(qū)從致密的核小體上暴露出來.在基因轉錄調控過程中,染色質重塑機制與組蛋白修飾機制協(xié)同發(fā)揮作用.最近,Chatterjee等研究證實了組蛋白H3的N末端乙酰化可以通過調節(jié)招募SWI/SNF染色質重塑復合體從而增強核小體的滑動.2swi/snf樣染色質重塑粉體的結構根據(jù)核心ATPase亞基的結構域特性,研究者將ATP依賴的染色質重塑復合體分為SWI/SNF、ISWI(imitationSWI)、CHD(chromodomain-helicaseDNAbinding)和INO80四類.目前研究最為透徹的是SWI/SNF染色質重塑復合體,其分子質量大于1Mu、由4~17個亞基組成,在酵母、果蠅、小鼠、人及植物等物種間高度保守.在酵母及動物和人類中,一般均含有由兩個不同的核心ATPase組成的SWI/SNF樣染色質重塑復合體,如酵母中的SWI/SNF和RSC復合體、果蠅中的BAP(brahmaassociateprotein)和PBAP(polybromo-associatedBAP)復合體以及小鼠和人類中的BAF(BRG1associatedfactor,核心酶為BRM或者BRG1)和PBAF復合體(polybromo-associatedBAF,核心酶為BRG1).相對于酵母以及動物而言,植物中有關SWI/SNF樣復合體的生化研究尚屬起步階段,在本文中將結合河北師范大學分子細胞生物學實驗室的研究工作進行詳細介紹.2.1baf染色認知了是否具有組織器官特異性酵母作為單細胞生物,其SWI/SNF染色質重塑復合體較單一.隨著單細胞到多細胞生物的進化過程,產生了一系列的重要事件,如在果蠅中開始出現(xiàn)了連接型組蛋白與組蛋白甲基化的產生.其復合體組成形式以及功能也比酵母中更加復雜,其中BAP111是果蠅中特有的DNA結合蛋白,推測可能與果蠅中染色質復雜化增加有關(圖1).脊椎動物組織器官更加復雜,相應的染色質重塑機制也更加精密.染色質重塑復合體在保持核心組分的同時,即保持總體復合體的大小以及重塑活性的同時,在其他的組分上會出現(xiàn)多樣性,表現(xiàn)為具有組織器官特異性組分的置換以及增加,可以構成上百種不同的復合體形式.到目前為止,在小鼠以及人類的SWI/SNF染色質重塑復合體中,已鑒定到由25個基因編碼的14個BAF組分.例如在BAF60的位置可以由三種亞基BAF60a、BAF60b或者BAF60c置換組成.由于某些BAF亞基只是特定在某一些類型細胞中出現(xiàn),因此出現(xiàn)了一系列組織器官特異或者細胞類型特異的BAF復合體.例如只在神經細胞中特異存在的神經元BAF復合體(nBAF)中,即因其含有特異組分BAF60b、BAF53b以及BAF45b而命名在高等動物及人類細胞中,染色質重塑復合體在基因的轉錄表達、DNA修復與復制、細胞信號轉導、基因組穩(wěn)定性的維持、細胞的增殖與分化、干細胞的多能性與自我更新、生殖細胞形成、器官發(fā)育、腫瘤抑制等方面發(fā)揮重要作用(圖1).目前SWI/SNF復合體多個組分被證實發(fā)揮腫瘤抑制因子的功能.近期,外顯子測序揭示超過20%的腫瘤細胞出現(xiàn)了BAF染色質重塑復合體組分的突變.2013年,Kadoch等研究發(fā)現(xiàn)人類BAF復合體新組分SS18蛋白中,僅僅兩個氨基酸的突變即引發(fā)癌變.綜上所述,在進化過程中,高等動物中染色質重塑復合體的組成以及功能出現(xiàn)多樣性以適應組織器官的復雜性.值得注意的是,最近越來越多的研究表明,染色質重塑復合體與腫瘤抑制關系密切,因此深入研究表觀遺傳染色質重塑機制的抑癌機理,對于在臨床上找到重要的腫瘤藥物治療靶點方面具有重要意義.2.2植物中swi/snf抑制劑變化情況與酵母Snf2和果蠅Brahma核心酶結構相似,擬南芥SWI/SNF復合體推測的核心酶ATPase結構域包括N端的SNF2結構域和C端的Helic結構域(圖2).BRM的C端含有一個與染色質結合相關的類似BROMO結構域和AT-hook的DNA結合基序;SYD的C端只含有預測的AT-hook的DNA結合基序和一個很長的C末端;而MINU1/2分子質量比較小,C端沒有預測的結構域(圖2).酵母Snf2和果蠅BrahmaC端含有與組蛋白錨定相關的SnAC結構域,而在擬南芥4個預測的SWI/SNF類ATPase中均不存在(圖2).N端預測的結構域中,與其他核心酶不同的是,MINU1和MINU2只有與細胞核ARPs結合的HSA結構域,沒有參與蛋白-蛋白互作的QLQ結構域(圖2).植物SWI/SNF類核心酶結構特點可能預示著在植物中SWI/SNF核心酶存在一些不同于酵母及動物方面的特性,同時相對于酵母以及人類等具有兩種核心酶而言,植物中核心酶的數(shù)量增多暗示著其染色質重塑復合體可能存在有別于動物特有的復雜多樣性.在酵母和人類中,SWI/SNF染色質重塑復合體含有2個SWI3亞基.然而植物的SWI3蛋白更具多樣性,在擬南芥中含有4個SWI3蛋白,水稻中含有6個SWI3蛋白(表1).與酵母中Swi3、果蠅中Moira、小鼠中Srg3以及人類中的BAF170和BAF155一樣,擬南芥以及水稻中的SWI3蛋白均含有保守的與染色質DNA結合的SWIRM結構域、與組蛋白結合的SANT結構域,以及參與蛋白-蛋白互作的亮氨酸拉鏈(leucinezipper,LZ)基序.SWI3A和SWI3B可以形成同源和異源二聚體,并與BSH(SNF5的同源蛋白)、SWI3C和RNA結合蛋白FCA直接相互作用.酵母雙雜交表明SWI3D與SWI3B有直接相互作用.Doris實驗室通過體外沉降(pulldown)實驗證實了核心酶SYD可以與SWI3A以及SWI3B有較強的蛋白互作,與SWI3C有較弱的蛋白互作.而Farrona等證實了SWI3C與核心酶BRM有直接的蛋白互作.這些生化證據(jù)在一定程度上暗示著植物SWI3蛋白在不同的SWI/SNF類復合體中可能存在著不同的組成形式,在復合體多樣性中發(fā)揮作用.研究者們期望可以利用生化手段解析植物中SWI/SNF類染色質重塑復合體的組分,但由于在植物中染色質重塑復合體的純化難度較酵母、小鼠等體系更大,因此至今為止相關的生化證據(jù)仍較匱乏.Farrona等通過凝膠層析實驗證實了植物中預測的染色質重塑核心酶BRM存在于一個分子質量大約在1~2Mu之間的復合體中,但并沒有解析其所在復合體的組成成分.最近我們實驗室利用免疫親和純化及串聯(lián)質譜分析的方法,首次解析了擬南芥SWI/SNF類染色質重塑復合體的生化組分,并發(fā)現(xiàn)我們實驗室首報的LFR(leafandflowerrelated)蛋白可能是植物SWI/SNF復合體中特有的新組分.值得注意的是,在我們純化得到的SWI/SNF復合體中,既包含與已有生物信息學預測吻合的11個組分,也同時含有其他未預測到的植物特有組分.擬南芥LFR作為植物特有的蛋白,與人類SWI/SNF復合體的成員BAF200的部分蛋白有28%的同源性.但是,從嚴格意義上來講,LFR并不是BAF200的同源蛋白.BAF200是人類PBAF復合體中特有的亞基,含有特異保守的ARID結構域,其分子質量為200ku.LFR蛋白只有51ku大小,并且含有3個保守的蛋白相互作用ARM-reapeat結構域,其與BAF200的同源區(qū)不在保守的ARID區(qū)域.由此可見,植物的染色質重塑復合體組分在進化中與其他真核生物有所不同.我們推測與植物在進化中具有的特有的發(fā)育模式有關.植物胚胎后發(fā)育具有明顯不同于高等動物胚胎后發(fā)育的特征,新生側生器官的發(fā)生占據(jù)了植物胚胎后個體發(fā)育的很長時間,這有可能是植物具有特有的SWI/SNF復合體組分的原因.3染色質重塑基因功能敲除的有效性在小鼠等高等動物模型系統(tǒng)中研究染色質重塑復合體的功能還存在一定的局限性,這主要是由于復合體組分的基因功能敲除往往造成胚胎致死,這就使得后續(xù)個體發(fā)育的研究難以進行.與動物系統(tǒng)不同的是,在模式植物如擬南芥中,大多數(shù)推測的染色質重塑組分相關基因的功能敲減或敲除突變體植株可以存活,且能完成個體發(fā)育周期(表2),因此為染色質重塑在生物體生長發(fā)育全過程中的功能研究提供了良好的實驗材料.3.1核心酶brm和syd與果蠅中Brm和小鼠中Brg1等突變造成致死現(xiàn)象不同的是,植物中SWI/SNF染色質重塑復合體核心酶SYD和BRM的缺失突變體可以正常存活完成整個生活史,但是在生長的各個時期都有多種發(fā)育缺陷表型,均表現(xiàn)為植株矮小、生長緩慢、葉片變小并卷曲.雙重缺失突變體brmsyd是胚胎致死的,這表明SYD和BRM功能冗余地調節(jié)植物胚胎發(fā)育過程.SYD和BRM部分功能冗余地上調CUC(CUP-SHAPEDCOTYLEDON)家族基因的表達,從而影響子葉分離,其中SYD只是影響CUC2的表達,BRM則影響了所有CUC家族成員CUC1~3的表達.最近的研究證明,SYD和BRM在花器官形態(tài)建成和激活APETALA3(AP3)和AGAMOUS(AG)基因表達方面也有冗余現(xiàn)象.但基因芯片的結果顯示,SYD與BRM調控的基因只有一小部分出現(xiàn)重疊,說明這兩種核心酶的作用并不完全冗余.SYD所在的染色質重塑復合體通過結合WUSCHEL啟動子區(qū)進而調控其轉錄表達,在花頂端分生干細胞的維持方面發(fā)揮重要作用.BRM參與調控花器官決定基因以及開花途徑轉錄因子的表達.最近的研究證明,BRM的構象調節(jié)作用使開花抑制因子FLC的染色質區(qū)處于轉錄抑制狀態(tài).最近,一系列研究表明核心酶BRM和SYD與植物生長激素信號通路以及環(huán)境脅迫相關.2013年,Efroni等研究表明,BRM通過染色質重塑機制調控bHLH(basic-helix-loop-helix)類轉錄因子和與bHLH相關的CIN-TCPs轉錄因子的表達,在細胞分裂素(CTK)通路的轉錄調控以及控制葉片成熟方面發(fā)揮重要作用.Han等發(fā)現(xiàn)BRM參與抑制植物對脫落酸(ABA)信號的反應.核心酶SYD調控茉莉酮酸酯(JA)和乙烯(ET)信號通路下游基因的轉錄表達,在植物抗病以及抗環(huán)境脅迫等信號通路中發(fā)揮重要作用.另外兩種推測的核心酶組分CHR23和CHR12的單突變體在正常生長條件下均沒有明顯表型.在逆境條件下,CHR12超表達植株的頂端分生組織面積明顯要比野生型小.近期,本實驗室以及Doris研究小組通過遺傳學方法證實,CHR12和CHR23轉錄本完全缺失的雙重突變體產生胚胎致死表型.CHR12和CHR23的弱表型等位雙突變體可以發(fā)育形成可存活的小苗,但在根與頂端分生組織的干細胞維持方面均出現(xiàn)發(fā)育缺陷,最終發(fā)育形成的植株矮小多枝,根據(jù)突變體的表型CHR12和CHR23又被命名為MINU1和MINU2.目前研究者通過遺傳學、基因組學、分子生物學等方法證實了植物中SWI/SNF的核心ATP酶在植物發(fā)育中發(fā)揮重要作用,而關于其是否具有染色質重塑活性以及ATP酶生化特性等還有待深入研究.3.2aba信號通路影響通過遺傳學分析,擬南芥中SWI3家族呈現(xiàn)出功能的多樣性.swi3a和swi3b突變體在早期球形胚期出現(xiàn)胚胎發(fā)育停滯的表型.與swi3a不同的是,swi3b可能是受到遺傳印記的影響,其胚珠的發(fā)育停滯導致分離比的異常,出現(xiàn)一半比例的大孢子和小孢子致死現(xiàn)象.2013年,Wierzbicki實驗室研究發(fā)現(xiàn),SWI3B與長非編碼RNA(lncDNA)結合蛋白IDN2存在蛋白相互作用,并共同調控122個基因的轉錄沉默,表明染色質重塑與非編碼RNA介導的基因沉默在基因調控方面協(xié)同發(fā)揮作用.SWI3B可以與ABA信號通路負調節(jié)因子HAB1直接相互作用,并且共同調控ABA信號通路下游基因RAB18和RD29B的表達.有意思的是,swi3c突變體與swi3b在ABA處理下的表型截然相反,對ABA信號超敏感,在ABA處理下出現(xiàn)植株半矮化、種子萌發(fā)以及根伸長受抑制、葉片卷曲、雄蕊發(fā)育異常以及育性降低等現(xiàn)象.swi3d突變體的植株異常矮小、花器官的數(shù)目和形態(tài)發(fā)育均出現(xiàn)異常,并且雌雄性完全不育.以上結果證實了植物中的SWI3在生長發(fā)育中,尤其在生殖發(fā)育方面發(fā)揮著重要的功能,這一點與動物中的SWI3蛋白極為相似.但與動物不同的是,不同的植物SWI3蛋白發(fā)揮的作用不同,暗示著該家族蛋白可能參與形成不同的SWI/SNF復合體形式.3.3基因表達及分子活性在擬南芥中,BSH是唯一與SNF5同源的單基因(表1).實驗證明BSH可以恢復酵母中snf5突變體的表型.BSH部分基因沉默的突變體造成發(fā)育多方面的缺陷,包括頂端優(yōu)勢的喪失以及敗育,暗示著BSH具有多種生物學功能.2012年,Han等發(fā)現(xiàn)bsh-1突變體對ABA信號介導的抑制種子萌發(fā)現(xiàn)象不敏感,暗示著BSH在ABA信號通路中發(fā)揮作用.Swp73亞基在酵母Swi/Snf復合體中對轉錄激活方面發(fā)揮重要作用.擬南芥中編碼兩個與酵母SWP73同源的基因CHC1和CHC2(表1),它們之間具有83.7%的同源性.目前為止,這兩個基因的功能研究還未見報道.擬南芥中含有許多ARPs蛋白,分為8個亞家族,其中的6類與其他真核生物的Arp蛋白同源,另外兩類是植物特有的家族.擬南芥中的ARP4和ARP7蛋白定位于細胞核,與酵母的Arp4和人類的BAF53同源.arp4-1突變體中由于花粉發(fā)育缺陷造成育性部分喪失,arp7-1突變體的胚胎發(fā)育停滯在魚雷胚時期造成胚胎致死,這些表型暗示著其通過染色質重塑的調節(jié)在擬南芥的生殖發(fā)育中起著重要的作用.酵母SWI/SNF復合體中的Swi蛋白、果蠅BAP復合體中的OSA和人類BAF復合體中的BAF250均屬于ARID家族的成員.含有ARID結構域的蛋白可能參與轉錄調控并與胚胎發(fā)育、細胞分裂和細胞周期調控有關.在擬南芥中存在一些預測的ARID蛋白,但目前仍沒有證據(jù)表明這些蛋白是SWI/SNF復合體組分.我們實驗室的最新研究證實LFR蛋白是擬南芥染色質重塑復合體的一個重要組分.遺傳學分析表明,lfr突變體在營養(yǎng)生長階段的子葉和真葉以及生殖生長時期的花器官等均出現(xiàn)明顯的發(fā)育缺陷,表現(xiàn)為子葉間夾角變小、葉脈紊亂、蓮座葉上卷、花絲變短、雌雄蕊發(fā)育異常、育性喪失等.花序材料的基因芯片證據(jù)表明,LFR調控一系列轉錄因子等基因的表達.有意思的是,LFR與核心酶SYD調控的基因存在很高的重疊性,進一步表明LFR-SYD染色質重塑復合體在植物發(fā)育過程及基因表達調控等方面發(fā)揮著重要作用(河北師范大學分子細胞生物學實驗室待發(fā)表數(shù)據(jù)).4植物中swi/snf染色復配的可能表達近20年來,科研工作者們已經在酵母、果蠅以及人類細胞中純化得到了SWI/SNF染色質重塑復合體,并在復合體的多樣性以及功能機制研究方面進行了大量透徹的研究.隨著基因組學、蛋白質組學的應用與發(fā)展,在小鼠以及人類等高等動物中SWI/SNF染色質重塑復合體各組分參與細胞的增殖分化、信號轉導、腫瘤發(fā)生等過程中的調控機制也逐步得以闡明.而植物胚胎后發(fā)育具有明顯不同于高等動物胚胎后發(fā)育的特征,因此我們推測植物的染色質重塑復合體組分在進化中與其他真核生物有所不同.本實驗室有關LFR的研究工作也印證了我們的推測,在植物中確實存在不同于其他物種的染色質重塑組分.植物中染色質重塑組分,例如核心ATP酶以及SWI3家族的同源組分,均多于動物中的相應同源組分,而這些同源蛋白在植物體內發(fā)揮的作用又不完全冗余,因此在植物不同的發(fā)育時期和不同的組織中,這些同源組分可能參與形成不同的染色質重塑復合體.另