三七h(yuǎn)plc指紋圖譜的影響因素研究

三七h(yuǎn)plc指紋圖譜的影響因素研究

中藥三七是三七科植物種類(lèi)的花三七。主產(chǎn)于我國(guó)云南、廣西,是我國(guó)特產(chǎn)的傳統(tǒng)珍貴藥材。具有散瘀止血、消腫定痛等多種藥理和生物活性,它是經(jīng)典的止血良藥,用于咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等,熟用補(bǔ)血、和血,用于貧血、虛弱、月經(jīng)不調(diào)等。云南民間認(rèn)為三七尚有滋補(bǔ)強(qiáng)壯作用。近年來(lái)對(duì)中藥三七的指紋圖譜有較多的研究報(bào)道,建立了多種三七指紋圖譜的分析方法,并且已有人用指紋圖譜來(lái)區(qū)分三七及其混淆品和分析三七藥材及制劑。我們課題組也已經(jīng)建立了簡(jiǎn)便、快速,重現(xiàn)性良好的中藥三七高效液相色譜指紋圖譜的分析方法,并運(yùn)用該方法分析了不同生長(zhǎng)年限和不同藥用部位的三七樣品,較好地反映了這些樣品間的差異。三七采挖后在產(chǎn)地一般采用自然干燥方法,但是遇陰雨天時(shí)需要烘干,所以在商品中存在晾干(曬干)或烘干的產(chǎn)品。不同的干燥方法對(duì)三七化學(xué)成分會(huì)造成什么影響,體現(xiàn)在指紋圖譜上會(huì)發(fā)生什么變化目前還沒(méi)有研究報(bào)道。因此,作者考察了不同干燥方法三七樣品的HPLC指紋譜。另外,新鮮藥材在干燥過(guò)程中水分逐漸丟失,使干燥過(guò)程中藥材的含水量不斷減少;干燥后的藥材在保存過(guò)程中由于受到保存環(huán)境的溫度和濕度等的影響,也會(huì)引起藥材中含水量的變化,為了考察藥材的干燥過(guò)程和藥材含水量對(duì)于指紋圖譜有什么樣的影響,我們對(duì)新鮮和干燥三七藥材及干燥過(guò)程中的不同階段的藥材進(jìn)行了HPLC指紋譜研究。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們又讓已經(jīng)干燥的藥材吸水、軟化,然后測(cè)定其HPLC指紋譜,力求闡明藥材干燥程度對(duì)指紋圖譜的影響規(guī)律。另外三七商品有整三七(個(gè)子藥材)、三七片、三七粉等不同狀態(tài),在保存過(guò)程中其質(zhì)量是否會(huì)發(fā)生變化,若有變化又會(huì)對(duì)指紋圖譜產(chǎn)生什么樣的影響呢?為解決這些問(wèn)題,作者分別觀察了三七整主根(個(gè)子藥材)、主根切片(三七片)和主根粉末(三七粉)這三種狀態(tài)藥材的指紋圖譜,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了分析研究。1儀器、藥品和藥品AgilentHP1100高效液相色譜儀,DAD檢測(cè)器;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A(上海亞榮生化儀器廠);超聲波清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠,功率100～250W可調(diào));FW80型微型高速萬(wàn)能試樣粉碎機(jī)(天津泰斯特公司);SHZ-3(Ⅲ)型循環(huán)水多用真空泵;202-2BS型電熱恒溫干燥箱(天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司,功率2.0kW)。甲醇(分析純);甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)Fisher公司);雙蒸水。三七成分對(duì)照品:三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和Re、人參皂苷Rb1、和人參皂苷Rd均購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院有機(jī)教研室;三七皂苷R4、三七皂苷Fa和三七皂苷Fc均由日本富山醫(yī)科藥科大學(xué)和漢藥研究所小松かっ子教授提供。三七藥材見(jiàn)表1,包括云南省7個(gè)產(chǎn)地的約250個(gè)個(gè)體的2～3年生三七,由北京大學(xué)藥學(xué)院生藥研究室蔡少青教授鑒定為Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen。取樣時(shí),每個(gè)編號(hào)的藥材樣品取主根10頭左右進(jìn)行粉碎、提取和分析,平行操作兩份。色譜柱:Luna5μC18(250×4.6mm),流動(dòng)相:乙腈-水梯度洗脫,梯度設(shè)置見(jiàn)表2,流速1.0ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)200nm。3實(shí)驗(yàn)方法3.1干燥藥材高效液相色譜分析取新鮮采集的藥材三七全根(編號(hào)為2649、Y01028、0208001、0208002、0208009、030101、030102),去除根莖、側(cè)根、須根及全根根尖得整主根,各編號(hào)的整主根再分別分成整主根(整三七)和主根切片(三七片)兩種狀態(tài),并分別采用陰干和烘干方式進(jìn)行干燥,對(duì)所得干燥藥材分別進(jìn)行高效液相色譜分析。3.1.1切3.1.2干燥3.1.3尹干3.1.4干燥樣品溶液的制備方法3.2hplc分析分別取編號(hào)為0208015、030109和030112三份樣品的新鮮三七藥材的整主根在室溫下陰干并分別取新鮮、干燥過(guò)程中和完全干燥的藥材按下列方法制成樣品液后進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析。3.2.1測(cè)定失重情況的確定取新鮮的三七主根7～9頭,整體稱(chēng)重記錄。將已稱(chēng)重的藥材在室溫下干燥,監(jiān)測(cè)干燥過(guò)程中的失重情況,按照失重的比例換算成鮮材的質(zhì)量,仍然按鮮材比溶劑為2/25的比例加入溶劑(V2)進(jìn)行提取。如干燥過(guò)程中的藥材質(zhì)量為Y克,比鮮材失重a%,利用X/V1=[Y/(1-a%)]/V2=2/25的關(guān)系式計(jì)算出V2,進(jìn)行提取。3.2.3干燥樣品溶液的制備方法見(jiàn)“3.1.4”項(xiàng)下。3.2.4相對(duì)峰面積的計(jì)算軟化后的藥材取7～9頭,按照增重的比例換算成干燥藥材的質(zhì)量,按干燥藥材比溶劑為1/25加入溶劑(V3)進(jìn)行提取。如軟化后藥材質(zhì)量為Z克,比干燥藥材增重b%,利用[Z/(1+b%)]/V3=1/25的關(guān)系式計(jì)算出V3,進(jìn)行提取。為了較為客觀地反映不同干燥程度藥材之間量的關(guān)系,我們引入了計(jì)算相對(duì)峰面積的數(shù)據(jù)處理方法。選取S峰(2號(hào)峰人參皂苷Rg1+Re,保留時(shí)間為15.8～16.2min)作為參照峰,某一色譜峰的峰面積與它的峰面積的比值即為該色譜峰的相對(duì)峰面積。計(jì)算公式為:AR=Ai/As,AR表示某一色譜峰的相對(duì)峰面積,Ai表示某一色譜峰的面積,As表示參照峰的面積。相對(duì)峰面積的引入有利于對(duì)取樣量不完全相同時(shí)不同樣品間對(duì)應(yīng)色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度的比較。3.3樣品的制備方法將新鮮采集的樣品(020001)若干頭主根隨機(jī)分成3組,對(duì)其中1組進(jìn)行切片,為三七片藥材組,另2組不切片,作為整三七。三七片與整三七均在室溫環(huán)境(相對(duì)濕度30%)下陰干。陰干的2組整三七,取其中1組粉碎成粉末,過(guò)40目篩,作為三七粉組。將干燥后的主根三七片、整三七、三七粉樣品分別置于棕色廣口瓶中,室溫保存。分別于保存0,10,20,30d(1個(gè)月)、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月后進(jìn)行取樣分析。取樣方法:①整三七:隨機(jī)取整三七樣品7～9頭(約10～14g),粉碎,過(guò)40目篩。②三七片:隨機(jī)取三七片樣品約10～14g,粉碎,過(guò)40目篩。③三七粉:將三七粉末混合均勻。①～③組樣品均分別精密稱(chēng)取粉末1g,平行兩份取樣,分別按“3.1.4”項(xiàng)下方法制備樣品液。4香辛料參數(shù)對(duì)客觀范圍內(nèi)人參皂苷的影響空白實(shí)驗(yàn)表明干擾雜質(zhì)的色譜峰峰高均低于100mAU,不會(huì)對(duì)樣品測(cè)定造成干擾。經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證,證明本論文的色譜學(xué)方法有良好的重現(xiàn)性,所考察的色譜峰的保留時(shí)間RSD在1%以下,峰面積RSD在5%以下。本文中所涉及的重要色譜峰以數(shù)字編號(hào),并以標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照,其在各樣品中的保留時(shí)間(tR)分別在下列范圍內(nèi):1號(hào)(三七皂苷R1,14.6～14.9min),2號(hào)(人參皂苷Rg1+Re,15.8～16.2min),3號(hào)(三七皂苷R4,21.5～22.0min),4號(hào)(三七皂苷Fa,21.6～22.5min),5號(hào)(人參皂苷Rb1,22.8～23.4min),6號(hào)(三七皂苷Fc,23.7～24.4min),7號(hào)(24.5～25.4min),8號(hào)(24.8～25.5min),9號(hào)(人參皂苷Rd,25.7～26.2min),10號(hào)(36.2～36.6min),11號(hào)(42.9～43.3min),12號(hào)(43.2～43.8min),13號(hào)(46.2～46.7min),14號(hào)(48.0～48.4min),15號(hào)(49.3～50.5min),16號(hào)(51.4～52.1min),17號(hào)(53.5～55.0min),18號(hào)(55.0～56.4min),19號(hào)(56.5～57.6min),20號(hào)(58.4～59.3min)。4.1峰面積值分布于整主根不同的干燥方法下得到的色譜圖見(jiàn)圖1～4。干燥方法對(duì)三七指紋圖譜的峰數(shù)沒(méi)有影響,對(duì)三七中不同的組分峰面積的影響不同,如表3中所示,大致包括以下幾種情況:(1)1號(hào)(三七皂苷R1)、6號(hào)(三七皂苷Fc)、13號(hào)、16號(hào)組分不論是切片狀態(tài)或者整主根狀態(tài)均在陰干條件下峰面積值高于烘干條件下的峰面積,且這4個(gè)峰在整主根陰干時(shí)均有最大的峰面積,其中13號(hào)色譜峰在整主根狀態(tài)下的峰面積值均高于切片狀態(tài)的峰面積,而16號(hào)色譜峰烘干條件下,整主根狀態(tài)有高于或近等于切片狀態(tài)的峰面積值。(2)7號(hào)和9號(hào)(人參皂苷Rd)組分整主根在烘干條件下峰面積值高于陰干條件下的峰面積;切片狀態(tài)在烘干條件下峰面積值高于或近等于陰干條件下的峰面積值。9號(hào)色譜峰在切片狀態(tài)下烘干的峰面積值還高于整主根狀態(tài)下烘干和陰干的峰面積。(3)3號(hào)(三七皂苷R4)、4號(hào)(三七皂苷Fa)和5號(hào)(人參皂苷Rb1)色譜峰在陰干和烘干兩種條件下,及12號(hào)色譜峰在陰干條件下,切片峰面積值均高于整主根的峰面積值;12號(hào)色譜峰在烘干條件下,切片峰面積值高于或近等于整主根的峰面積值。(4)8號(hào)、10號(hào)、17號(hào)、18號(hào)、19號(hào)、20號(hào)色譜峰整主根狀態(tài)下烘干和陰干的峰面積值均分別高于切片烘干和陰干的峰面積值。且18號(hào)和19號(hào)色譜峰在整主根狀態(tài)下(無(wú)論烘干還是陰干)的峰面積均高于切片狀態(tài)下(無(wú)論烘干還是陰干)的峰面積值。4.2皂苷類(lèi)成分分析新鮮藥材與干燥藥材相比[圖5～7分別代表新鮮藥材、干燥過(guò)程中的藥材(失重約30%)、干燥后藥材(失重約60%)的指紋圖譜],保留時(shí)間在30min以前的色譜峰在數(shù)目和強(qiáng)度上都沒(méi)有明顯的差異,新鮮藥材的15號(hào)色譜峰(保留時(shí)間49.2～49.7min)響應(yīng)很高,其強(qiáng)度超過(guò)了13號(hào)和16號(hào)色譜峰。在干燥過(guò)程中,15號(hào)色譜峰強(qiáng)度逐漸下降,而13號(hào)和16號(hào)色譜峰強(qiáng)度則逐漸升高。13號(hào)、15號(hào)和16號(hào)色譜峰的紫外圖譜表明它們均具有皂苷類(lèi)成分特征。藥材完全干燥以后,15號(hào)色譜峰的響應(yīng)很低,峰面積的積分值小于50,低于最小檢測(cè)面積,以S峰(2號(hào)峰)為參照峰的相對(duì)峰面積約為0.2%,而新鮮和失重在30%左右的藥材中,相對(duì)峰面積在12.7%～28.1%之間,峰強(qiáng)度相差60～140倍,同時(shí),在干燥過(guò)程中,55min以后的極性較小的18號(hào)和19號(hào)色譜峰相對(duì)峰面積也逐漸增大。15號(hào)色譜峰在軟化藥材(見(jiàn)圖8,軟化藥材比干燥藥材增重約30%)中又有明顯大于干燥藥材的相對(duì)峰面積值,達(dá)到了0.7%～1.4%;而13號(hào)、16號(hào)、18號(hào)和19號(hào)峰在軟化藥材中又明顯小于干燥藥材中的相對(duì)峰面積,可見(jiàn)藥材由新鮮到干燥所發(fā)生的變化是部分可逆的。因此可以認(rèn)為15號(hào)色譜峰是新鮮主根和含水主根的特征峰。表4給出了這13號(hào)、15號(hào)、16號(hào)、18號(hào)和19號(hào)5個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積變化情況。4.3不同保存狀態(tài)樣品的色譜峰面積變化不同狀態(tài)的三七藥材在保存過(guò)程中色譜峰絕對(duì)峰面積的變化規(guī)律有如下相同點(diǎn):(1)10號(hào)色譜峰和12號(hào)色譜峰的峰面積隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。(2)3、6、7、8、11、13、18、19和20號(hào)色譜峰峰面積隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。(3)1號(hào)色譜峰的峰面積在保存過(guò)程中變化相對(duì)較小。其中10號(hào)和12號(hào)色譜峰峰面積的增高是保存中最特征的變化。以粉末保存為例,圖9、10、11和12分別是粉末藥材保存0天、30天、2個(gè)月和6個(gè)月的指紋圖譜,將保存過(guò)程中10號(hào)和12號(hào)色譜峰的峰面積隨保存時(shí)間的變化用圖13中的折線圖來(lái)表示,可以看出兩個(gè)峰的峰面積持續(xù)上升,其紫外圖譜顯示10號(hào)色譜峰具皂苷類(lèi)成分特征,而12號(hào)色譜峰未顯示皂苷類(lèi)成分特征。不同狀態(tài)的三七在保存過(guò)程中的峰面積變化又有不相同的地方,表5中列出了以粉末、三七片和整三七不同狀態(tài)的三七樣品分別在保存0天、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)的峰面積值,并計(jì)算了色譜峰在保存12個(gè)月時(shí)比保存0天時(shí)峰面積增加的數(shù)值。由表5中的結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn):(1)第10和12號(hào)色譜峰峰面積增加,這在不同保存狀態(tài)的樣品中是一致的。(2)以粉末保存時(shí),1號(hào)和5號(hào)色譜峰在12個(gè)月內(nèi)的峰面積值變化較小,組分在保存過(guò)程中基本穩(wěn)定;三七片狀態(tài)下1號(hào)、2號(hào)、9號(hào)和17號(hào)色譜峰在保存中變化較小;整三七狀態(tài)下1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、9號(hào)、13號(hào)、16號(hào)和17號(hào)色譜峰在保存過(guò)程中變化較小。狀態(tài)越完整,保存中變化小,比較穩(wěn)定的色譜峰就越多。(3)三七片和整三七狀態(tài)的樣品在不同保存期的峰面積數(shù)值有上下波動(dòng),而粉末狀態(tài)的樣品峰面積數(shù)值變化方向穩(wěn)定。5存時(shí)間對(duì)三組hplc指紋圖譜的影響本文考察了三七藥材的干燥方法、干燥程度及保存時(shí)間對(duì)三七HPLC指紋圖譜的影響,找到了一些規(guī)律性變化,得到以下結(jié)論,這些結(jié)論對(duì)于利用指紋譜鑒別和控制三七藥材質(zhì)量有著實(shí)際意義。5.1干燥配方的影響5.1.1烘干使一些組分峰面積降低,切片干燥亦使得組分峰面積降低。1號(hào)、6號(hào)、13號(hào)和16號(hào)色譜峰無(wú)論是切片狀態(tài)或是整主根狀態(tài)在陰干條件下峰面積值均高于烘干條件下的峰面積值,說(shuō)明干燥溫度對(duì)組分的影響較大,高溫干燥造成這4個(gè)組分的峰面積降低。這4個(gè)色譜峰在陰干的整主根中有最大的峰面積值,說(shuō)明這4個(gè)組分的峰面積不但受到溫度的影響,而且受到藥材狀態(tài)完整性的影響,尤其是對(duì)于13號(hào)和16號(hào)組分來(lái)說(shuō),三七整主根藥材干燥比切片干燥更有利于其組分峰面積的保持。5.1.2烘干使得一些組分峰面積升高。7號(hào)和9號(hào)色譜峰在整主根(整三七)烘干樣品中的峰面積高于陰干樣品,在切片烘干樣品中的峰面積高于或近等于陰干樣品。其中9號(hào)峰為人參皂苷Rd,是一種原人參二醇型三糖苷,它的峰面積增加是否由于三七中含有的原人參二醇型四糖皂苷或五糖皂苷受熱后降解造成的,有待研究。5.1.3切片干燥使一些組分峰面積升高。3、4、5、12號(hào)色譜峰在三七片中的峰面積高于在整主根中的峰面積。這可能是由于切片使得藥材的內(nèi)部暴露在空氣中,促使某些成分發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化,從而生成了相應(yīng)的產(chǎn)物,使得3、4、5、12號(hào)色譜峰峰面積增加。5.1.4保留時(shí)間在45min以后的17、18、19、20號(hào)色譜峰在整三七中的峰面積高于在三七片中的峰面積。這可能是由于完整藥材的內(nèi)部組織未被暴露,而有利于17、18、19和20號(hào)色譜峰這樣的低極性組分含量的保持,而切片藥材則相反。因此若要減少三七中低極性成分的損失,應(yīng)采用以完整主根進(jìn)行陰干的方法干燥三七藥材為宜。而以何種干燥方法進(jìn)行干燥以使三七各化學(xué)成分具有適當(dāng)?shù)谋壤P(guān)系,需用藥效評(píng)價(jià)方法最終確定。5.2相對(duì)峰面積和峰強(qiáng)度5.2.1我們發(fā)現(xiàn)了新鮮藥材的特征色譜峰為15號(hào)色譜峰。藥材完全干燥以后,15號(hào)色譜峰的響應(yīng)很低,峰面積的積分值小于50,低于最小檢測(cè)面積,相對(duì)峰面積約為0.2%,而新鮮藥材和失重約30%的藥材中,其相對(duì)峰面積在12.7%～28.1%之間,峰強(qiáng)度相差60～140倍,在軟化藥材中相對(duì)峰面積又回升到了0.7%～1.4%。第15號(hào)色譜峰的相對(duì)峰面積可以用作判斷藥材含水量的多少的參考,在藥材干燥和加工過(guò)程中具有鑒別意義。5.2.2干燥過(guò)程中隨著藥材含水量的減少,13、16、18、19號(hào)組分的相對(duì)峰面積明顯較其他成分的相對(duì)峰面積增加。5.3色譜峰峰面積隨時(shí)間的變化5.3.110號(hào)色譜峰和12號(hào)色譜峰的峰面積隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。原因可能是在保存過(guò)程中其他性質(zhì)不穩(wěn)定的組分發(fā)生了降解,生成上述產(chǎn)物,使得10號(hào)和12號(hào)色譜峰峰面積增加。5.3.23號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、11號(hào)、13號(hào)、18號(hào)、19號(hào)和20號(hào)色譜峰峰面積隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。這些組分大部分的保留時(shí)間位于45min之后,是一些極性較低的成分,隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)這些組分峰面積降低,可能與這些組分容易揮發(fā)損失有關(guān)。5.3.3不同狀態(tài)的三七在保存過(guò)程中,粉末中各個(gè)組分的變化幅度較大,三七片和整三七的變化幅度較小。推測(cè)這是由于整三七樣品結(jié)構(gòu)完整沒(méi)有經(jīng)過(guò)切片或者粉碎,組分相應(yīng)的變化在整三七中速度較慢。所以為了保持三七化學(xué)成分的穩(wěn)定,宜以整主根的狀態(tài)來(lái)長(zhǎng)期保存三七藥材。2七樣品液的制備用刀片將新鮮三七整主根(個(gè)子藥材)橫切成厚約0.1～0.2cm的薄片(橫向切片可減少在分析藥材時(shí)由于切片中皮部和木質(zhì)部比例的不同而造成取樣的不均勻性)。在烘箱中烘干,溫度控制在35.0±1.0℃。從手感藥材干燥(約需4～5d)后開(kāi)始,每隔12h稱(chēng)重1