寒熱證動(dòng)物模型研究進(jìn)展

寒熱證動(dòng)物模型研究進(jìn)展

本文在過(guò)去15年中對(duì)軟寒熱綜合征的一般模型進(jìn)行了如下研究。1冷杉動(dòng)物模型1.1寒凝瘀證的制備黎敬波等選用Wistar大鼠進(jìn)行胃潰瘍實(shí)寒證造模。給大鼠微量注射20%醋酸造成大鼠胃潰瘍,再灌飼冰水施加寒性刺激,第7d開(kāi)始檢測(cè)指標(biāo),成功制成胃實(shí)寒證模型。陳艷芳等采用冰NaOH或冰水+NaOH造成胃寒Ⅰ°和Ⅱ°模型,多次試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)造模大鼠的一般狀況、胃黏膜的病理組織形態(tài)、微觀指標(biāo)變化等都符合中醫(yī)臨床寒證的表現(xiàn),并以溫性藥為主的反左金丸反證了寒證模型的成功?！秲?nèi)經(jīng)》云:“……寒獨(dú)留,則血凝泣,凝則脈不通?！焙畡t凝,凝則成瘀,故寒邪易致寒凝血瘀。鄭小偉[3、4]以中醫(yī)理論為指導(dǎo),運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段,在正常大鼠測(cè)定呼吸頻率后,將其置于罩有鐵網(wǎng)的瓷盤(pán)上,放入-15℃冰箱中持續(xù)受凍4h左右,當(dāng)動(dòng)物處于興奮減弱期時(shí)復(fù)制出寒邪傷陽(yáng)所致的陽(yáng)虛寒凝血瘀證。吳墾莉等對(duì)家兔后肢局部冷凍,引起紫紺、水腫等癥狀,造成家兔寒凝血瘀證動(dòng)物模型,以造模后第3~5天各項(xiàng)病理形態(tài)學(xué)變化最為明顯。王學(xué)江等用同樣的方法建立了小鼠寒凝血瘀證模型。倪瑾[7~8]等將冷凍組家兔的雙側(cè)后肢上、下、左、右圍置低溫冰袋(-25℃~-20℃),冷凍1.5h,1d~5d后復(fù)制出寒凝血瘀模型。成秀梅等人則將大鼠置于0℃~1℃冰水中20min,每日1次,連續(xù)2周,造成寒凝血瘀證大鼠模型,并經(jīng)溫經(jīng)湯進(jìn)行方藥反證,大鼠寒性癥狀明顯改善。寒凝血瘀證模型多以受試動(dòng)物的血液流變學(xué)、微循環(huán)、血凝、血栓素、血流量等指標(biāo)作為模型評(píng)價(jià)依據(jù)。楊士友等根據(jù)中醫(yī)“風(fēng)為百病之長(zhǎng)”的理論,將SD大鼠置于模擬風(fēng)(5~6級(jí))、寒(3℃~7℃)環(huán)境中,前期(6d)表現(xiàn)符合中醫(yī)風(fēng)寒表證的癥狀;后期(14d)表現(xiàn)符合中醫(yī)的寒凝血瘀證,見(jiàn)血液增黏、增稠、增聚,微循環(huán)流態(tài)惡化,微血管管徑、流速、流量降低。此外,還有在腎上腺素+寒冷刺激的復(fù)合因素作用下造寒凝血瘀證模型。滕久祥等[11、12]采用皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素2次,并在給藥之間于5℃~8℃水中浸泡5min的方法造成大鼠寒凝血瘀模型。蔡錚等運(yùn)用靜脈注射大量腎上腺素加冰水浴造成寒凝血瘀證家兔模型。1.2制備200%的水餅由于味苦性寒涼中藥易傷陽(yáng)氣,陽(yáng)虛則內(nèi)寒,長(zhǎng)期大量灌胃寒涼藥的大鼠可呈現(xiàn)出寒證的某些特征,以脾陽(yáng)虛為主。陳小野用山梔子、黃芩、龍膽草、蓮子心、知母(1∶1∶1∶1∶1)制成水煎劑,1.5g/只,1次給藥,30min出現(xiàn)虛寒癥狀,制成寒證模型。此外,他也用利血平肌注,用藥量10ug/只/d,7至8d可造成虛寒證動(dòng)物模型。該模型從第5天起出現(xiàn)較穩(wěn)定的中醫(yī)臨床寒證特點(diǎn)。周小軍等選用清潔級(jí)豚鼠,用知母、黃柏、生石膏、龍膽(1.5∶1∶1∶1.5)制成180%水煎劑灌胃,每天10g/kg,1次給藥,用藥4周制成豚鼠寒證模型。李良等在梁月華早期建立的動(dòng)物模型基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)造模方法,直接用知母、石膏(1∶1)制成1kg/L的水溶液,灌胃Wistar雄性大鼠,每天1次,4ml/只,3周后制成虛寒證模型。宋輝等用知母、石膏(3∶4)制成100%的水煎劑,4ml/d,1次灌胃Wistar雄性大鼠造模,3周后制成虛寒證模型,停止喂藥后虛寒狀態(tài)持續(xù)7d以上,并認(rèn)為是研究藥物治療的良好模型。陳小野等對(duì)上述虛寒證的造模方法進(jìn)行了總結(jié),認(rèn)為以上虛寒證模型雖基本得到了公認(rèn),但存在兩個(gè)環(huán)節(jié)的不足:一是可能未能在寒證的基礎(chǔ)上達(dá)到寒邪傷陽(yáng)而致模;二是虛證尚未達(dá)到“精氣奪則虛”的程度。于是加大造模劑量,延長(zhǎng)造模時(shí)間,選擇雌性WistarII級(jí)大鼠按體質(zhì)分組,用知母、生石膏、黃柏、龍膽草(1.5∶2.0∶1.0∶1.2)常規(guī)制成200%煎劑,灌胃28d后,模型有較深程度的寒證表現(xiàn),并出現(xiàn)虛證。邱賽紅等人選擇分別用冰食醋或氫氧化鈉給大鼠灌胃建立寒證模型,認(rèn)為食醋法造模所制備的脾胃虛寒模型較氫氧化鈉穩(wěn)定,并與中醫(yī)寒證更接近。周燦平等選用KM種小鼠,采用控制飲食+游泳的方法復(fù)制出體虛模型,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)典型的臨床“虛寒證”特點(diǎn)。2熱效應(yīng)動(dòng)物模型2.1中醫(yī)臨床熱證“氣有余便是火”,氣過(guò)盛則易出現(xiàn)火象,表現(xiàn)為實(shí)火、實(shí)熱證,因此補(bǔ)氣藥可用于實(shí)熱證造模。梁氏等選用雌性大白鼠,首先喂黨參、黃芪1周,隨后自皮下注射致熱物松節(jié)油2ml引起發(fā)熱,體溫可達(dá)40.30℃,持續(xù)3d,隨后恢復(fù)。此種方法克服了單純用黨參或單純用松節(jié)油只引起發(fā)熱,而交感神經(jīng)和內(nèi)分泌變化不大的缺點(diǎn),更符合臨床實(shí)熱證病人的表現(xiàn)。陳群等用黨參、黃芪(1∶1)制成1g/ml的水溶液,4ml/d/只,2周后成功造出實(shí)熱證模型。黎敬波以化學(xué)因素、中醫(yī)傳統(tǒng)病因、客觀指標(biāo)為根據(jù),選用Wistar大鼠進(jìn)行胃潰瘍實(shí)熱證造模。采用20%醋酸微量注射導(dǎo)致胃潰瘍,然后施加病因刺激,灌飼辣椒汁、白酒混合液,造成胃實(shí)熱證模型。第7d開(kāi)始檢測(cè)指標(biāo),結(jié)果表明胃潰瘍實(shí)熱證模型組造模成功。陳艷芬等采用乙醇或辣椒+乙醇造成胃熱Ⅰ°和Ⅱ°模型,多次試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),造模大鼠的一般狀況、胃黏膜的病理組織形態(tài)、微觀指標(biāo)變化等都符合中醫(yī)臨床熱證的表現(xiàn),并以左金丸反證了熱證模型的成功。山麗梅采用辣椒汁加60°白酒灌胃兩周,最后3d夾尾激怒的方法成功建立了大鼠胃熱證模型。周燦平等選用KM種小鼠,采用飼喂高蛋白飼料的方法復(fù)制出體盛模型,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)典型的臨床“熱證”特點(diǎn)。田在善以化學(xué)因素、客觀指標(biāo)、藥物反證為依據(jù)復(fù)制動(dòng)物模型,給大鼠尾靜脈注醋酸鉛、5-羥色胺后,立即經(jīng)胃內(nèi)灌注脂多糖,進(jìn)行腸源性內(nèi)毒素腸熱證造模。其造模結(jié)果與中醫(yī)腸熱腑實(shí)證基本吻合,且大承氣湯具有明顯的保護(hù)作用。另外,模擬發(fā)生熱性病的病因,以細(xì)菌、病毒、內(nèi)毒素等作為致毒材料,通過(guò)給動(dòng)物體內(nèi)注大腸桿菌、巴氏桿菌、肺炎雙球菌產(chǎn)生內(nèi)毒素而發(fā)熱,或直接注入內(nèi)毒素而引起實(shí)熱證,動(dòng)物多選用兔或大鼠進(jìn)行研究。2.2中醫(yī)模型的建立虛熱證動(dòng)物模型是中醫(yī)證候動(dòng)物模型中研究較多的1種。以北京醫(yī)科大學(xué)研制的較為典型,他們使用溫?zé)犷?lèi)中藥,以熱甚耗傷陰液為病機(jī),制成虛熱證模型。如用附子、干姜(1∶1)制成100%水煎劑,每日4ml,1次灌胃,3周即可。陳小野等也選用溫?zé)犷?lèi)中藥如附子、肉桂、仙茅、仙靈脾等份制成水煎劑灌喂雌性小鼠,用藥7d,小鼠表現(xiàn)出一系列的虛熱癥狀?；蚋阶?、干姜、麻黃、蒼術(shù)、豬苓等份水煎劑灌喂大鼠,共26周。通過(guò)胃黏膜檢測(cè)和舌象觀察,其癥狀基本符合中醫(yī)陰虛熱盛證的表現(xiàn)。陳群用附子、干姜、肉桂(1∶1∶1)制成1g/ml的水溶液,4ml/d/只,2周后成功造出虛熱證模型。周小軍等選用清潔級(jí)豚鼠,用附子、干姜、肉桂(1∶1∶1)制成180%水煎劑,每天10g/kg灌胃,每天1次,用藥4周制成豚鼠熱證模型。施天華等用附子、干姜(1∶1)制成100%水煎劑,每日4ml,1次灌服,喂藥3周造成虛熱證模型。周永生等改進(jìn)現(xiàn)行的虛熱證動(dòng)物模型,加大造模劑量,延長(zhǎng)灌胃時(shí)間,選擇雌性WistarII級(jí)大鼠,按體質(zhì)分組,用熟附子、肉桂、干姜(1∶1∶1)制成200%煎劑灌胃,4ml/只,每天1次,再以肉桂、干姜(1∶1)制成200%煎劑灌胃,4ml/只,每天2次(實(shí)驗(yàn)第17天起3次/d),用藥28d,發(fā)現(xiàn)造模大鼠不但有熱證表現(xiàn),而且有一定的虛證表現(xiàn)。梁念海等選用SD大鼠,用溫?zé)嶂兴幐山鳛樵炷９ぞ咚?給大鼠灌胃干姜水煎劑復(fù)制出胃熱證動(dòng)物模型,并且發(fā)現(xiàn)中、高劑量的干姜水煎劑與辣椒汁和白酒(50%)混合液效果相當(dāng)。汪文娟用昆明種小鼠灌胃附子干姜肉桂水煎劑,同時(shí)5%乙醇代水隨意飲用,3周后造出胃陰虛熱證病理模型。王秋等選用日本大耳白兔,先用禁水禁食和速尿二度利尿脫水造成“陰津虧虛”狀態(tài),再以注射大腸桿菌內(nèi)毒素以致“熱盛”,使受試對(duì)象產(chǎn)生陰虛內(nèi)熱的表現(xiàn)。3心溫、熱、常體等體質(zhì)模型的篩選動(dòng)物證的模型以從動(dòng)物中篩選優(yōu)于復(fù)制,這符合“證根源于體質(zhì)”的思想。周志東等選用3月齡SD雄性青年大鼠,于實(shí)驗(yàn)前1月測(cè)定大鼠掌溫,每1~2周測(cè)溫1次,以各鼠掌溫高于或低于群體均值1℃以上者篩選“熱體”或“寒體”動(dòng)物。葉福媛等通過(guò)測(cè)量大鼠蹠心溫度3d,從Wistar大鼠自然群體中,以群體蹠心溫的均值為標(biāo)準(zhǔn)篩選出寒體、熱體、常體等體質(zhì)模型。張福利等每日測(cè)量Wistar大鼠體溫(肛溫)2次,連續(xù)4d,按體溫穩(wěn)定在36.2℃±0.3℃為寒體、37.2℃±0.2℃為常體、大于37.8℃±0.2℃為熱體的標(biāo)準(zhǔn)篩選寒熱體質(zhì)模型。韓巍等通過(guò)測(cè)定SD大鼠肛溫,每日1次,雌鼠連續(xù)測(cè)定6d,雄鼠連續(xù)5d,以雌鼠、雄鼠群體的平均肛溫為標(biāo)準(zhǔn),篩選出寒熱體模型。陳小野等選用10種北京市目前常用的Wistar實(shí)驗(yàn)大鼠Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、SDⅠ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、CD(SD)IGSⅢ級(jí)(小體重組)、CD(SD)IGSⅢ級(jí)(大體重組)、SHRI級(jí)、SHR/spⅠ級(jí),通過(guò)檢測(cè)外觀、舌象、下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能,運(yùn)用中醫(yī)學(xué)理論進(jìn)行體質(zhì)初步分析,篩選出虛寒、虛熱、實(shí)熱、正常等體質(zhì)的大鼠。陳氏等又以8~9周齡昆明、BALB/c、C57BL/6J、ICR小鼠,以及4~5周齡昆明小鼠為研究對(duì)象,同步系統(tǒng)檢測(cè)其生物學(xué)特性,然后以統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)了這4種品系小鼠的寒、熱體質(zhì)。4中醫(yī)證候動(dòng)物模型的復(fù)制和驗(yàn)證近10余年來(lái),國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)寒熱證動(dòng)物模型的研制做了許多有益的探索,產(chǎn)生了一些原創(chuàng)性的造模方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),推進(jìn)了動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化進(jìn)程,并對(duì)其他相關(guān)中醫(yī)證候模型的成功復(fù)制起到了一定的示范和引領(lǐng)作用。首先是多指標(biāo)合參思想評(píng)價(jià)動(dòng)物模型的引入,更加符合中醫(yī)臨床上以微小證候群為病理基礎(chǔ)的“證”的宏觀整體特征。其次表現(xiàn)在對(duì)寒熱證型虛性病理的處理上,根據(jù)中醫(yī)陰盛(寒)必然傷陽(yáng),陽(yáng)盛(熱)必然傷陰的理論,有些研究者開(kāi)始通過(guò)加大造模劑量,延長(zhǎng)造模時(shí)間,分別復(fù)制出陽(yáng)虛或陰虛的寒熱證候動(dòng)物模型,使其在寒熱證病理存在的同時(shí)保證虛證的存在。另外,以保持自身原有機(jī)能狀態(tài)為特征和優(yōu)勢(shì)的寒熱自然體質(zhì)模型的提出和研究也為動(dòng)物模型擬臨床病理狀態(tài)提供了一種新的模式和方法。盡管如此,寒熱證動(dòng)物模型的復(fù)制仍存在諸多不足和歧義,遠(yuǎn)未取得突破性進(jìn)展。就目前來(lái)看,寒熱證動(dòng)物模型的復(fù)制仍多采用寒熱溫度刺激或寒熱性藥物等某一單一因素刺激致病,這顯然有悖于臨床上病人致病因素多樣化的客觀情況,另外,施加因素的刺激強(qiáng)度以及作用時(shí)間也缺乏合理的客觀依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)?？梢?jiàn),擬臨床病因的多元化致病因素的聯(lián)合應(yīng)用研究及其相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建立仍是今后尚需加強(qiáng)和重點(diǎn)研究的方向和領(lǐng)域之一。模型的判定和評(píng)價(jià)是動(dòng)物模型制備過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是模型成功與否的決定因素。盡管寒熱證動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)趨于多樣化,但缺乏與“證”的病理相對(duì)應(yīng)的特異性強(qiáng)的客觀指標(biāo),而這些客觀指標(biāo)的獲取和建立則有賴于證候的客觀化研究。關(guān)于這方面的研究,可以借鑒腎陽(yáng)虛和脾虛證本質(zhì)研究的思路和成功經(jīng)驗(yàn),以臨床病人為突破口,通過(guò)選擇典型的寒熱證病人,收集血液、尿液、唾液等容易獲取的樣本,進(jìn)行生化及組學(xué)分析,發(fā)掘能夠表征中醫(yī)“證”的病理狀態(tài)的生物學(xué)信息,應(yīng)該是一條探尋寒熱證“生物標(biāo)記物”的有效途徑?？傊?中醫(yī)證候動(dòng)物模型的研制只有在立足于中醫(yī)學(xué)整體思維模式的基礎(chǔ)上,充分汲取分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等現(xiàn)代生命科學(xué)知識(shí),并不斷融合數(shù)學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)及數(shù)據(jù)挖掘等方法和手段,提取證候的現(xiàn)代生物學(xué)信息,才能逐步增加具有量化標(biāo)準(zhǔn)的客觀指標(biāo)在證候判斷