蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)狀與展望

蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)狀與展望

蛋白質(zhì)組的概念由澳大利亞科學(xué)家wilkin和威廉姆斯在1994年提出，并在1995年7月首次發(fā)表。它指的是由同一個矩陣、細(xì)胞、組織或生物表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是以細(xì)胞或組織不同時間、環(huán)境的所有蛋白質(zhì)為研究對象,從整體上研究蛋白質(zhì)的種類、相互作用以及功能結(jié)構(gòu)的一門科學(xué),其強(qiáng)調(diào)蛋白質(zhì)類型與數(shù)量在不同種類、不同時間和條件下的動態(tài)本質(zhì),從而在細(xì)胞和生命有機(jī)體的整體水平上闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)和活動規(guī)律。這種思路與中醫(yī)認(rèn)識疾病的整體觀念具有趨同性,可謂不謀而合。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要是指利用雙向電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離,再用計算機(jī)軟件進(jìn)行圖像分析,然后通過質(zhì)譜分析技術(shù)及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫信息對目的蛋白進(jìn)行分析和鑒定的方法。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,已被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。不同因素作用于人體,引起從遺傳信息到整體功能實現(xiàn)中的分子、細(xì)胞、器官、整體多個層面的結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)的改變,調(diào)節(jié)這些層面的結(jié)構(gòu)與功能的本質(zhì)是基因,而直接的作用者主要是蛋白質(zhì)。因此,以蛋白質(zhì)表達(dá)為指標(biāo),以蛋白質(zhì)調(diào)控改變和功能修飾為研究對象,進(jìn)行中醫(yī)藥研究也是可行的。近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被逐漸應(yīng)用到中醫(yī)藥研究領(lǐng)域,并取得了一定成果。主要在以下幾個方面:1高血壓肝陽上保持組織生長的大鼠一般資料的表達(dá)證候是疾病發(fā)展過程中某一階段的病機(jī)概括,是機(jī)體內(nèi)因和環(huán)境外因綜合作用的機(jī)體反應(yīng)狀態(tài),并隨著病程的發(fā)展而變化。這些反應(yīng)變化只有在表達(dá)為相應(yīng)的蛋白質(zhì)后才能最終影響生物功能。進(jìn)行不同中醫(yī)證候產(chǎn)生前后蛋白質(zhì)組學(xué)研究,探究中醫(yī)證候產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)支配機(jī)制,揭示中醫(yī)證候的科學(xué)內(nèi)涵,能夠為中醫(yī)診斷的客觀化提供依據(jù)和方法。肝陽上亢證是常見中醫(yī)證型之一,多見于原發(fā)性高血壓、甲亢、中風(fēng)等病。李臻琰等采用自發(fā)性高血壓大鼠加灌附子湯復(fù)制高血壓肝陽上亢證大鼠模型,造模成功后自發(fā)性高血壓大鼠出現(xiàn)肝陽上亢證候表現(xiàn);用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離各組大鼠下丘腦的總蛋白質(zhì),經(jīng)考馬斯亮蘭染色,PDQuest7.0軟件分析;與正常組比較,肝陽上亢證組中蛋白質(zhì)點表達(dá)上升2倍及以上的點有26個,下降2倍及以上的點有97個,這些下丘腦的表達(dá)差異蛋白可能與高血壓肝陽上亢證有關(guān)。張嫻等建立并分析正常、高血壓肝陽上亢模型大鼠脾單個核細(xì)胞蛋白圖譜和正常人、原發(fā)性高血壓肝陽上亢患者外周血單個核細(xì)胞的蛋白圖譜,與正常組比較,發(fā)現(xiàn)高血壓肝陽上亢大鼠組獨有點387個,而高血壓肝陽上亢患者組獨有點515個,這為進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,探討高血壓肝陽上亢證的分子機(jī)制提供了實驗基礎(chǔ)。目前,還利用蛋白質(zhì)組學(xué)對腎陽虛證、血瘀證、血虛證、肝郁證、慢性胃炎濕證等證的本質(zhì)進(jìn)行了研究。筆者認(rèn)為從動物和人體兩個方面,通過對不同疾病的同一證型(異病同證)和同一疾病的不同證型(同病異證)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,逐步完善從而全面展示證候的科學(xué)內(nèi)涵,探尋病證的診斷性蛋白,為診斷的客觀化提供確實的科學(xué)依據(jù)是可行的。2酰胺凝膠蛋白電泳檢測針刺肌肉中的分子質(zhì)量針灸以其獨特的方法和臨床有效性正在被越來越多的國家和地區(qū)所接受并推廣應(yīng)用開來。針灸具有雙向調(diào)節(jié)作用,其調(diào)節(jié)作用可通過多途徑實現(xiàn),如神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)等,表明了針灸效應(yīng)的客觀性。以針灸臨床有效性為基礎(chǔ)的針灸作用原理研究,引出了針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的深層次問題,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)則有可能成為打開這扇門的一把鑰匙。王靜等采用變性聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳方法,對多種針刺位點的大鼠胃經(jīng)和任脈沿線(循經(jīng))脂肪條帶結(jié)構(gòu)勻漿上清液進(jìn)行變性蛋白電泳,并對電泳圖譜條帶識別比對分析,發(fā)現(xiàn)針刺大鼠胃經(jīng)和任脈線上的腧穴和非穴點,其相應(yīng)沿線脂肪條帶結(jié)構(gòu)勻漿蛋白電泳表現(xiàn)出相同的差異性條帶,故認(rèn)為表達(dá)差異的蛋白是針刺產(chǎn)生的經(jīng)絡(luò)效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。石學(xué)敏等[12、13]采用優(yōu)化的雙向電泳技術(shù)條件建立了高質(zhì)量的、穩(wěn)定的、高度重復(fù)性的大鼠腦皮質(zhì)、海馬蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜,并以基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定了84個蛋白,初步建立了大鼠腦皮質(zhì)、海馬蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫;并構(gòu)建了局灶性腦缺血模型大鼠腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)組差異表達(dá)圖譜;同時發(fā)現(xiàn)了針刺治療的部分效應(yīng)蛋白,包括熱休克蛋白及分子伴侶、抗氧化蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、信號蛋白、炎癥反應(yīng)蛋白、生長因子、神經(jīng)元特異蛋白等;早期介入“醒腦開竅”針刺對腦梗死超早期、急性期患者血漿神經(jīng)肽Y(NPY)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)也具有良性調(diào)整作用。這些進(jìn)一步揭示了“醒腦開竅”針刺的腦保護(hù)作用及抗損傷修復(fù)機(jī)制,其治療腦缺血性卒中是通過多途徑、多靶點、多層次的整體調(diào)整作用的結(jié)果。3抗炎活性成分的篩選目前用傳統(tǒng)方法進(jìn)行中藥研究,在取得積極進(jìn)展和大量成果的同時,也發(fā)現(xiàn)存在許多問題,如提取和純化程度越高,療效越不理想;對中藥的作用機(jī)制仍然處于初步認(rèn)識階段,多數(shù)停留在藥效觀察水平。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,使我們能通過對用藥前后組織或細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組展示來評價中藥的藥效,而且可以針對其中特異表達(dá)或差異表達(dá)顯著的蛋白點進(jìn)行更深一步的后續(xù)質(zhì)譜鑒定研究,確定藥物作用的靶蛋白,這種全景式分析研究方法必將大大加速中藥活性篩選過程。張萃等通過內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型,從丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、鹽酸川芎嗪、阿魏酸、姜黃素、莪術(shù)油中篩選抗炎活血化瘀中藥單體,發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型有明顯抑制作用,雙向電泳圖象分析篩選出差異性明顯的蛋白質(zhì)點26個。模型組有16個蛋白點增高,丹參酮ⅡA能使其中的13個蛋白點下調(diào)(占50%),3個進(jìn)一步上調(diào)(占11.5%);而對模型組表達(dá)下調(diào)的10個蛋白點,丹參酮ⅡA對其均有不同程度上調(diào)趨勢。故內(nèi)毒素感染的細(xì)胞模型適合實驗室小劑量中藥單體的篩選,丹參酮ⅡA的抗炎作用與這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)有關(guān),能夠調(diào)節(jié)一些蛋白質(zhì)的表達(dá)。若進(jìn)一步開展蛋白質(zhì)鑒定分析,則有可能發(fā)現(xiàn)靶點蛋白,從而為篩選中藥單體活性物質(zhì)提供支持。4馬中心蝦養(yǎng)殖大鼠腎組織中蛋白表達(dá)差異中藥毒性的研究備受世人矚目,建立符合國際標(biāo)準(zhǔn)的中藥安全性評價體系,已成為亟待解決的重大課題。現(xiàn)階段中藥毒性研究主要集中在組織形態(tài)學(xué)的改變及生化指標(biāo)檢測,而缺乏深入的機(jī)理研究。運用中醫(yī)的思維方式,結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),開展中藥毒性研究,揭示中藥產(chǎn)生毒性作用的機(jī)制,找出其關(guān)鍵環(huán)節(jié)和作用靶點,予以干預(yù),可達(dá)到減輕其毒性作用的目的。孫世仁等應(yīng)用馬兜鈴酸腹腔注射制備大鼠慢性馬兜鈴酸腎病模型,提取其腎組織中總蛋白質(zhì),采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù),對模型組和正常組腎組織中蛋白質(zhì)進(jìn)行差異展示,建立了模型組和正常組大鼠腎組織的雙向電泳圖譜,發(fā)現(xiàn)了差異蛋白質(zhì),并認(rèn)為這些蛋白質(zhì)可能介導(dǎo)了馬兜鈴酸的毒性作用;同時發(fā)現(xiàn)12周時馬兜鈴酸誘導(dǎo)腎間質(zhì)開始出現(xiàn)纖維化(早期),并進(jìn)一步對馬兜鈴酸誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化早期(12周)大鼠模型的腎組織和正常大鼠腎組織進(jìn)行蛋白差異展示,并用分析軟件進(jìn)行分析,結(jié)果顯示雙向電泳圖譜的匹配率可達(dá)83.4%,同時可見一些明顯差異的蛋白質(zhì)點,提示這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能參與馬兜鈴酸致腎損害早期過程的毒性作用,可能成為馬兜鈴酸導(dǎo)致腎纖維化的始動分子。一旦確定,這將使早期診斷和早期治療(在蛋白質(zhì)或基因水平進(jìn)行干預(yù)和阻斷)成為可能。5對云南紫草寧的應(yīng)用研究中藥資源稀缺的問題雖然通過人工栽培的方式得到了緩解,但仍未得到解決。而且藥材中有效成分往往含量甚微,通過功能基因組和蛋白質(zhì)組研究,可以對生物體中影響有效或毒性成分合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行調(diào)控,促進(jìn)其表達(dá),提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量,降低毒性成分和非有效成分含量,甚而實現(xiàn)單獨生產(chǎn)有效成分等等,基于此進(jìn)行的品種改良和細(xì)胞培養(yǎng)工程將會為解決中藥資源短缺問題提供幫助,同時也可提高中藥的安全性。張文舉等應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了不同光信號下滇紫草培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜,通過ImageMaster2DElite5.0軟件包進(jìn)行蛋白點的檢測、配比和差異分析,發(fā)現(xiàn)90個差異蛋白質(zhì)點,經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定,與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行匹配分析表明,發(fā)現(xiàn)一些在數(shù)據(jù)庫中無匹配蛋白的差異蛋白質(zhì)點,并認(rèn)為其中可能包括一些重要的與紫草寧次生代謝調(diào)控相關(guān)的新蛋白,在未來的研究中運用串聯(lián)質(zhì)譜等技術(shù)做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能分析,將會為深入揭示光信號調(diào)控的紫草寧合成的分子機(jī)制提供更多的依據(jù)。向秋等[18則采用雙向電泳(2-DE)技術(shù)構(gòu)建不同時期羅漢果蛋白質(zhì)組圖譜,應(yīng)用ImageMaster2D圖像分析軟件進(jìn)行分析,并認(rèn)為羅漢果生長、發(fā)育和成熟的不同階段受特定基因的表達(dá)調(diào)控,為羅漢果的開發(fā)和品種改良開辟了新方向。6蛋白質(zhì)組在中醫(yī)藥中的應(yīng)用由于宏觀上中藥作用靶點和作用機(jī)制的多樣性及對基因作用的多樣性,中藥蛋白質(zhì)組學(xué)指紋圖譜,可在分子水平上豐富整個中藥指紋圖譜研究體系。中藥蛋白質(zhì)組學(xué)指紋圖譜除了能夠較全面地提供中藥材及中藥制劑的復(fù)雜物質(zhì)基礎(chǔ)的大量信息,同時還能提供量效相關(guān)信息,起到鑒定和研發(fā)的雙重作用,比較不同蛋白質(zhì)指紋圖譜體現(xiàn)的不同藥效結(jié)果,就可確定該制劑的最佳成分配伍,這對于中成藥的二次開發(fā)和中藥新藥的研制有顯著的意義。Lum等利用2-DE研究了西洋參主根、人參不同取材部位(主根、側(cè)根、蘆頭、表皮)以及組織培養(yǎng)野生人參細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜,結(jié)果顯示不同參樣本的2-DE圖譜(指紋譜)顯著不同,能夠輕易地分辨開來,而傳統(tǒng)的基于色譜和分析鑒定技術(shù)卻達(dá)不到這一效果。李春梅等應(yīng)用激光解析/離子化-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOFMS)對傳統(tǒng)中藥龜甲膠、阿膠蛋白/肽成分進(jìn)行蛋白質(zhì)組初步分析,分別獲得的有意義蛋白/肽共計6、9個。通過分析建立龜甲膠、阿膠蛋白質(zhì)/肽成分質(zhì)量指紋圖,可作為龜甲膠、阿膠數(shù)字化質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn);并為進(jìn)一步分離、純化及驗證龜甲膠、阿膠功能相關(guān)活性蛋白質(zhì)/肽成分提供可靠信息。綜上所述,目前將蛋白質(zhì)組引入到中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究很多,也取得了一定的成果,但仍存在一些問題,主要有:(1)大部分研究停留在對蛋白質(zhì)組表達(dá)差異現(xiàn)象的描述上,僅局限于極少部分細(xì)胞和組織,對差異蛋白所具有的生物學(xué)意義以及它們之間的相互聯(lián)系和作用研究很少,對靶點的探索研究也很少。(2)偏重于對中藥作用機(jī)制的研究,而對中醫(yī)基礎(chǔ)理論的幾個關(guān)鍵問題,如證本質(zhì)的研究、臟象理論等方面的研究較少。(3)雖然證本質(zhì)的研究有所涉及,但缺乏廣泛的異病同證和同病異證的研究,而這兩方面研究的結(jié)合對更完整地揭示中醫(yī)證候的本質(zhì)恰恰是很重要的。(4)