電針對慢性情緒應激大鼠下丘腦室旁核crh及其型受體mrna表達的影響

電針對慢性情緒應激大鼠下丘腦室旁核crh及其型受體mrna表達的影響

在現(xiàn)代社會，由各種負面情緒刺激引起的心理疾?。ㄈ缃箲]障礙等）的發(fā)病率日益增加。據(jù)美國最新調查顯示,在9282例人群中有26.2%的人至少患有一種符合美國精神疾病診斷(DSM-Ⅳ)的精神類疾病,其中焦慮障礙最為普遍且占比例最高(18.1%)。臨床研究表明,焦慮障礙患者存在明顯的下丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸功能異常,且電針治療焦慮障礙有其獨特優(yōu)勢,臨床療效肯定。然而,目前尚未見電針對焦慮障礙HPA軸作用機制的研究報道,故本實驗在前期行為學研究的基礎上,從HPA軸系統(tǒng)的關鍵結構之一下丘腦室旁核及其激活的關鍵環(huán)節(jié)促腎上腺皮質素釋放激素(CRH)出發(fā),通過觀察電針對下丘腦室旁核CRH及其Ⅰ型受體mRNA表達的影響,探討電針治療焦慮障礙的部分神經內分泌機制。1材料和方法1.1溫度保持適應性放養(yǎng)選用SD健康雄性大鼠33只,普通級,體重180~220g。實驗室的溫度保持在(23±2)℃左右,濕度70%~80%,安靜。動物自由進食、飲水,在實驗前適應性馴養(yǎng)7d。用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包完全隨機分組程序將大鼠分為3組,即空白組、模型組、電針組,每組11只。1.2圖像采集及跟蹤分析CRH免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司);CRHR1mRNA原位雜交試劑盒(武漢博士德生物技術公司);Leica4000B圖像采集系統(tǒng)及Qwin圖像分析軟件(德國Leica儀器有限公司);PM-200十字迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);G6805-Ⅱ型電針儀(青島鑫升實業(yè)有限公司)。1.3應激刺激的分配采用不可預知的慢性情緒應激(chronicemotionalstress,CES)刺激的造模方法復制焦慮模型。于第8天起除空白組外其它兩組動物均接受21d各種不同的應激刺激,包括電擊足底(每次持續(xù)5s,強度10mA,間隔30s,共20次)、禁水1h(15:00-18:00之間)、禁食1h(15:00-18:00之間)、24h光照、24h黑暗、兩籠(每籠3~4只動物)混為1籠、單籠、傾斜、從兩籠各抓兩只混籠共9種,用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包將此9種刺激隨機分配到21d中,每天安排1種應激刺激。1.4大鼠針刺前培訓在造模的同時,電針組進行電針治療。于每日下午15:00開始固定大鼠,選“百會”“三陰交”穴進行針刺。針刺“三陰交”時,單日取左側,雙日取右側。針柄接電針儀,選用疏密波,頻率15/25Hz,電流1~2mA,刺激強度以大鼠針刺側下肢輕微抖動為度。每日1次,每次15min,連續(xù)治療21d?？瞻捉M和模型組于相同時間進行與電針組相同的固定,不進行針刺治療。1.5動物的傳統(tǒng)外驅力學檢測各組大鼠于實驗結束后第2天,先進行高架十字迷宮行為學測試。高架十字迷宮裝置由呈“十”字型的4個臂區(qū)組成,對稱分布為開放臂區(qū)和閉臂區(qū)。實驗時將大鼠置于高架十字迷宮中央,運用視頻跟蹤系統(tǒng)自動監(jiān)測記錄5min內大鼠在開臂停留時間(open-armstime,OT)和進入開臂的次數(shù)(open-armsentries,OE)分別占進入兩臂區(qū)停留總時間和總次數(shù)的百分比(OT%和OE%)。動物在開臂停留時間越短(即OT%越小),或進入開臂次數(shù)越少(即OE%越小),表示其焦慮程度越大。行為學測試完畢后,各組大鼠立即用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30mg/kg),開胸暴露心臟,眼科剪剪開心尖,將灌注針經左心尖插入主動脈,剪開右心耳,快速注入100ml預熱(37℃)生理鹽水后,滴注預冷(4℃)的4%多聚甲醛DEPC(diethypyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)固定液(DEPC終濃度為0.1%)進行心臟灌注。剝取灌注后的動物腦組織,放入同種固定液中進行后固定,切取含室旁核的下丘腦,常規(guī)石蠟包埋,制成6μm切片,每組隨機取6只動物相同部位的切片2張進行檢測觀察。CRH免疫組化檢測:切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2滅活內源性酶,5%BSA(牛血清蛋白)室溫封閉20min,兔抗CRH抗體(1∶100)37℃孵育1.5h,生物素化羊抗兔IgG37℃孵育20min;鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(streptavidin-biotincomplex,SABC)37℃孵育20min,漂洗后用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)室溫下顯色。蘇木素輕度復染,脫水,透明,封片,顯微鏡下觀察。CRHR1mRNA原位雜交檢測:切片經漂洗、消化、預雜交后,地高辛標記CRHcDNA探針(濃度0.5mg/L)37℃雜交過夜;梯度系列標準檸檬酸鹽-氯化鈉漂洗后,5%BSA封閉液封閉,滴加生物素化鼠抗地高辛抗體(1∶1000稀釋)37℃孵育60min,生物素辣根過氧化物酶復合物37℃孵育20min,DAB顯色。蘇木素輕度復染,脫水,透明,封片,顯微鏡下觀察。采用Leica4000B圖像采集系統(tǒng)采集圖像,并用LeicaQwin圖像分析軟件對每張切片隨機選取的5個400倍視野圖像進行分析,計算平均吸光度。1.6統(tǒng)計分析方法數(shù)值用均數(shù)±標準差(ˉx±s)(xˉ±s)表示,SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行分析。采用單因素方差分析進行多組間比較,方差齊時用LSD檢驗,方差不齊時用Tamhane’sT2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義的標準。2結果2.1動物的焦慮狀態(tài)結果見圖1。模型組與空白組比較OT%和OE%均明顯下降(P<0.01),模型動物呈現(xiàn)明顯的焦慮狀態(tài),提示本實驗造模成功;經電針治療后,電針組OT%和OE%較模型組有明顯升高(P<0.01,P<0.05),而與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),提示電針有明顯降低動物焦慮情緒的作用。2.2腦室旁核小細胞內光鏡下觀察,CRH免疫組化陽性反應物和CRHR1mRNA原位雜交陽性表達反應物顯色均為棕黃色,主要分布于下丘腦室旁核小細胞內(見圖2和圖3)。比較各組大鼠下丘腦室旁核CRH和CRHR1mRNA平均吸光度值可見,模型組的CRH和CRHR1mRNA表達明顯高于空白組(P<0.05,P<0.01),而電針組則明顯低于模型組(P<0.05,P<0.01),說明電針具有降低焦慮大鼠下丘腦室旁核CRH及其R1mRNA表達的作用。見表1。3crh及其型受體的作用大量研究表明,當機體受到強烈、持久的刺激時,應激的基本反應為一系列的神經內分泌改變,主要表現(xiàn)為藍斑-交感-腎上腺髓質系統(tǒng)和HPA軸強烈興奮,前者參與急性期應激反應的調控,后者參與急性期后慢性應激反應的過程。下丘腦室旁核為HPA軸-神經內分泌軸的中樞控制位點,CRH則是HPA軸激活的關鍵環(huán)節(jié)。適量的CRH增多可使機體興奮或有愉快感;但大量CRH的增加,特別是慢性應激時CRH的持續(xù)增加則造成適應機制障礙,從而導致焦慮、抑郁等發(fā)生。進一步研究表明,在應激狀態(tài)下,CRH及CRHR1mRNA表達在下丘腦室旁核等區(qū)域均明顯增加。在焦慮和抑郁中觀察到的應激激素的變化主要由下丘腦神經肽CRH和加壓素的高分泌所致,CRH則是通過CRHⅠ型受體發(fā)揮其作用,使機體產生焦慮或抑郁樣癥狀。有證據(jù)表明,動物呈現(xiàn)焦慮樣反應時CRHR1mRNA表達的增強主要與內源性和/或外源性CRH釋放增加有關,提示可能與CRH神經元存在CRH自身反饋調節(jié)有關。新近的研究表明,CRHR1受體拮抗劑可作為新型抗焦慮和抑郁的神經藥理學治療手段?？梢?CRH及其Ⅰ型受體在焦慮發(fā)生中有其重要的地位。本研究觀察到CES模型組大鼠出現(xiàn)明顯的焦慮樣行為,且下丘腦室旁核CRH及其Ⅰ型受體表達明顯高于空白組,表明CES模型大鼠焦慮行為的發(fā)生與HPA軸的激活相關,這與文獻報道相似。結果還顯示,采用7種不同的應激方式交替作用于SD大鼠21d,造成慢性應激模型,大鼠的活動性降低,探究行為減少和HPA軸亢進,電針“百會”和“印堂”穴可能通過調整垂體促腎上腺皮質激素(ACTH)、腎上腺皮質酮(CORT)的過度分泌,從而糾正HPA軸亢進,進而改善慢性應激大鼠的行為學表現(xiàn)。電針“百會”“三陰交”穴可降低慢性應激抑郁模型動物血漿COR