綿羊mhc區(qū)drb1基因生物信息學(xué)分析

綿羊mhc區(qū)drb1基因生物信息學(xué)分析

主要組織的兼容配合體（mhs）是由緊密連接的高多態(tài)基因座組成的染色體遺傳區(qū)域。綿羊的MHC基因(OvineLymphocyteAntigen,OLA)位于20號(hào)染色體上,分為Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū),DRB1基因位于MHC基因復(fù)合體第Ⅱ區(qū)DR家族B類基因座上,具有豐富的多態(tài)性,并且OLAⅡ區(qū)在免疫應(yīng)答中起重要的調(diào)控作用。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)OLA-DRB1基因及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、序列特征、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析,有助于從分子水平上理解MHC-DRB1基本結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。同時(shí),通過與其他哺乳動(dòng)物的DRB1編碼產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,有助于比較不同哺乳動(dòng)物DRB1的差異和進(jìn)化關(guān)系,為進(jìn)一步開展深入研究提供參考。1材料和方法1.1drb1序列數(shù)據(jù)資料來源于NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫,包括綿羊(EU176819)、山羊(BAA23105)、歐洲牛(CAD32254)、羚羊(AAL57171)、亞洲水牛(AAZ765-44)、塔爾羊(AAL57172)、麝牛(AAK67170)、家犬(AAA91187)、豬(AAM55507)、馬(NP_001136287)、獼猴(CAE53059)和人類(AAX63463)的DRB1序列。括號(hào)內(nèi)為GenBank登錄號(hào)。1.2數(shù)據(jù)分析預(yù)測(cè)OLA-DRB1基因開放閱讀框采用NCBI的ORFFinder程序分析;DRB1編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)采用Bioedit及DNAStar分析軟件預(yù)測(cè);疏水性/親水性采用ProtScale預(yù)測(cè);蛋白信號(hào)肽采用SignalP預(yù)測(cè);亞細(xì)胞定位采用PSORTⅡ預(yù)測(cè);二級(jí)結(jié)構(gòu)采用Antheprot分析軟件預(yù)測(cè);結(jié)構(gòu)功能域及功能分類采用ProtFun預(yù)測(cè);多序列比對(duì)及同源性分析采用BLASTp程序及MegAlign軟件分析。2結(jié)果與分析2.1orf識(shí)別開放閱讀框是基因序列的一部分,包含一段可以編碼蛋白的堿基序列,不能被終止子打斷。DNA序列可以按6種框架閱讀和翻譯(每條鏈3種,對(duì)應(yīng)3種不同的起始密碼子)。ORF識(shí)別包括檢測(cè)這6個(gè)閱讀框架,并決定哪一個(gè)包含以啟動(dòng)子和終止子為界限的DNA序列而其內(nèi)部不包含啟動(dòng)子或密碼子,符合這些條件的序列有可能對(duì)應(yīng)一個(gè)真正的單一的基因產(chǎn)物。ORF的識(shí)別是證明一個(gè)新的DNA序列為特定的蛋白質(zhì)編碼基因的部分或全部的先決條件。本研究采用NCBI的ORFFinder程序,參照Kozak法則,尋找出一條長801bp的ORF(圖1),起始密碼子位于1bp,終止密碼子位于801bp,推測(cè)編碼266個(gè)氨基酸殘基。2.2drb1基因生物酶活性預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)包括其相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成和等電點(diǎn)等。用Bioedit及DNAStar分析軟件對(duì)綿羊DRB1基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè),DRB1基因的氨基酸組成見圖2。DRB1基因編碼266個(gè)氨基酸,組成中最多的兩種氨基酸是Leu(亮氨酸)和Arg(精氨酸),所占比例分別達(dá)到8.65%和8.27%。負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為27,正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為29,在pH7.0環(huán)境下其電荷量偏低,為3.122。其理論分子量約為30.43kD,理論等電點(diǎn)為8.086。2.3drb1蛋白疏水性及親水性分析瑞士生物信息學(xué)研究所的Protscale是一款預(yù)測(cè)分析疏水性/親水性的分析軟件。用DNAStar分析軟件對(duì)DRB1基因編碼產(chǎn)物的疏水性/親水性進(jìn)行預(yù)測(cè),其疏水性平均系數(shù)為0.337,參照ExPASy的Protscale程序計(jì)算DRB1編碼產(chǎn)物的疏水性/親水性圖譜(圖3)。分析氨基殘基的得分可知,多肽鏈的第239位的亮氨酸(Leu)具有最高的分值3.089,疏水性最強(qiáng);第159位的精氨酸(Arg)具有最低的分值-2.356,親水性最強(qiáng)。整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性,因此可推斷綿羊DRB1是一種可溶性蛋白。編碼產(chǎn)物的疏水性結(jié)果2.4drb1基因編碼產(chǎn)物的分析蛋白質(zhì)的定位是通過信號(hào)序列引導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。信號(hào)序列通常為15-60個(gè)氨基酸長度,位于新生肽的N端。信號(hào)序列根據(jù)運(yùn)輸方向的不同分為3種類型,即入核信號(hào)、引導(dǎo)肽和信號(hào)肽,其中信號(hào)肽指導(dǎo)內(nèi)膜系統(tǒng)的蛋白質(zhì)運(yùn)輸,且在完成蛋白質(zhì)定位后被切下。本研究采用丹麥Tekniske大學(xué)生物學(xué)序列分析中心提供的在線蛋白質(zhì)序列信號(hào)肽分析工具SignalPV2.0.b2對(duì)DRB1基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行了分析。在線輸入DRB1基因編碼產(chǎn)物的前70個(gè)氨基酸序列,程序分別自動(dòng)利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(NN)和隱馬爾可夫模型(HMM)進(jìn)行信號(hào)肽分析,并給出了3種C、Y、S-score計(jì)算結(jié)果。對(duì)于一個(gè)典型的信號(hào)肽,C值和Y值趨向于+1,S值在剪切位點(diǎn)之前高而在剪切位點(diǎn)之后變低。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(NN)預(yù)測(cè)的信號(hào)肽結(jié)果如圖4所示,隱馬爾可夫模型(HMM)預(yù)測(cè)的信號(hào)肽結(jié)果如圖5所示。綿羊DRB1編碼產(chǎn)物的分值曲線非常典型,C值為0.989,Y值為0.931,S值為0.984,其切割點(diǎn)位于29-30位的氨基酸之間,基本可以判定DRB1編碼產(chǎn)物存在信號(hào)肽。2.5drb1編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)一般通過算法比較查詢序列中所包含的特征參數(shù)與各類相應(yīng)的亞細(xì)胞定位的相似度,然后以一組概率值的形式作出判斷。通過工具PSORTⅡ預(yù)測(cè)DRB1編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位,從分析結(jié)果(表1)可知,其分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性為44.4%,分布在高爾基體的可能性為33.3%,分布在質(zhì)膜的可能性為22.2%。因此可以推斷,綿羊DRB1編碼產(chǎn)物主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用。2.6drb1編碼產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)及編碼產(chǎn)物的性質(zhì)預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要指多肽鏈依賴氫鍵排列成在一維方向上具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象,對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析有助于認(rèn)識(shí)蛋白的空間結(jié)構(gòu),采用Antheprot4.5分析軟件預(yù)測(cè)DRB1編碼產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu),分析結(jié)果如圖6和表2所示,綿羊DRB1編碼產(chǎn)物是由20%α-螺旋(Helix),22%延伸鏈(Sheet),15%β-轉(zhuǎn)角(Turn),43%無規(guī)則卷曲(Coil)組成。由此可推測(cè),無規(guī)則卷曲是綿羊DRB1最大量的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件,α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則散布于其整個(gè)蛋白質(zhì)中。2.7drb1編碼產(chǎn)物的功能預(yù)測(cè)丹麥技術(shù)大學(xué)生物學(xué)序列分析中心(CBS)的Protfun是一款預(yù)測(cè)分析蛋白結(jié)構(gòu)功能域及功能分類的分析軟件。本研究通過Protfun分析軟件預(yù)測(cè)DRB1編碼產(chǎn)物的功能,從分析結(jié)果(表3)可知,該蛋白具有免疫應(yīng)答(Immuneresponse)、受體(Receptor)、脅迫應(yīng)答(Stressresponse)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signaltransducer)功能的可能性分別為3.211、3.020、2.063、1.678,DRB1可能在免疫應(yīng)答和脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用,可能對(duì)綿羊免疫力和抗病性起關(guān)鍵作用。2.8drb1編碼產(chǎn)物的同源分析BLAST是一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或DNA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比較的分析工具。BLAST程序能迅速與公開數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性序列比較。BLAST結(jié)果中的得分是一種對(duì)相似性的統(tǒng)計(jì)說明。將綿羊DRB1編碼產(chǎn)物序列輸入至Blastp,搜索Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行同源蛋白搜索與比較。圖7可以看出,DRB1幾乎在所有的哺乳動(dòng)物中都有表達(dá),且與山羊、羚羊和牛等物種的蛋白同源性最高,高達(dá)90%以上,這也說明了它們?cè)谶M(jìn)化過程的親緣關(guān)系。通過從相關(guān)數(shù)據(jù)庫中收集下載各物種DRB1編碼產(chǎn)物的資料,本研究構(gòu)建了12個(gè)物種的DRB1系統(tǒng)發(fā)育樹(圖8)。從圖8可以看出,綿羊DRB1編碼產(chǎn)物與山羊、羚羊、塔爾羊和牛等物種上具有高度同源性,在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離最近。另外在其他一些物種上DRB1也具有極高的同源性,而且它們都有非常相近的生物學(xué)功能。3os4編碼產(chǎn)物的同源性在脊椎動(dòng)物中MHC是被廣泛、深入研究的一個(gè)基因區(qū)域。MHC是基因組中多態(tài)性最豐富的區(qū)域,對(duì)MHC遺傳變異分析可以提供物種的遺傳多樣性信息,因而具有重要的生物學(xué)意義。MHC的基因產(chǎn)物稱為MHC分子,是一類表達(dá)于細(xì)胞表面的脂蛋白,MHC分子主要與外來抗原相結(jié)合并將這些抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞,最終引起機(jī)體的免疫反應(yīng),因此,在脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。本研究通過蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、疏水性預(yù)測(cè),分析OLA-DRB1基因編碼蛋白功能。并且通過進(jìn)化比對(duì),發(fā)現(xiàn)綿羊DRB1基因與山羊、羚羊和牛的DRB1基因的分子進(jìn)化距離最近,親緣關(guān)系最為密切。這與動(dòng)物學(xué)分類結(jié)果一致,這種同源性在一定程度上代表著物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,同時(shí)也反映了DRB1編碼產(chǎn)物在不同物種結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性對(duì)生物體的功能重要性。從分析結(jié)果中可知,OLA-DRB1編碼產(chǎn)物由266個(gè)氨基酸組成,平均疏水系數(shù)為0.337,整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性,說明該蛋白質(zhì)的親水性較好,為水溶性蛋白,其二級(jí)結(jié)構(gòu)很容易接近水分子,OLA-DRB1編碼產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是以無規(guī)則卷曲和延伸鏈為主,主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用,并且預(yù)測(cè)出信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)位于29-30位的氨基酸之間,已知信號(hào)肽位于分泌蛋白的N端,它對(duì)于外分泌蛋白的分泌起主導(dǎo)作用。Antonio等發(fā)現(xiàn),改造了的信號(hào)肽可大大提高外源蛋白表達(dá)量。因此,在我們預(yù)測(cè)的信號(hào)肽位置進(jìn)行修飾,可以提高編碼蛋白在綿羊體內(nèi)的表達(dá)。功能分析預(yù)測(cè)該蛋白具有免疫應(yīng)答、受體、脅迫應(yīng)答和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能,可能對(duì)綿羊免疫力和抗病性起關(guān)鍵作用。通過序列的相似性檢索得到許多相關(guān)的相似序列,將這些相似序列做一個(gè)總體的比對(duì)從而觀察它們?cè)谛蛄薪Y(jié)構(gòu)上的異同。本研究利用Blastp方法在蛋白數(shù)據(jù)庫中對(duì)DRB1編碼產(chǎn)物進(jìn)行同源比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn),DRB1編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與山羊、羚羊、塔爾羊和牛的DRB1蛋白序列具有較高的同源性。使用蛋白質(zhì)序列進(jìn)行后續(xù)分析更能夠發(fā)現(xiàn)該研究對(duì)象的生物學(xué)意義,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)水平之間具有25%的同源性就可提示其功能的相似性