海洋細(xì)菌香港紅樹林的分離及次生代謝產(chǎn)物研究

海洋細(xì)菌香港紅樹林的分離及次生代謝產(chǎn)物研究

呂源天然產(chǎn)品一直是人類豐富的藥物資源。隨著對土地資源的深入研究，新藥物的初始化合物變化變得越來越困難。傳統(tǒng)抗生素抗劑性迅速發(fā)展，尤其是新菌病毒和新病毒。因此，人們逐漸關(guān)注尚未開發(fā)的巨大自然資源，尤其是海洋，并渴望找到新的藥物特征來地球。編號為4454的海洋真菌分離自香港紅樹林,種屬未定。本文首次研究了該菌的次級代謝產(chǎn)物,從其發(fā)酵培養(yǎng)液分離到3個化合物,通過分析波譜數(shù)據(jù)分別鑒定為尿嘧啶(A)、甘露醇(B)和草酸(C)。1實驗部分1.1儀器和試劑(1)核磁共振譜儀美國Varian公司INOVA500NB超導(dǎo)核磁共振譜儀,英國VG公司ZAB-HS雙聚焦磁質(zhì)譜儀,北京X4型顯微熔點儀(溫度計未校正)。(2)試劑和儀器葡萄糖(C,P.),蛋白胨(B,R.),酵母膏(B,R.),粗海鹽(微生物養(yǎng)殖用),溶劑為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)(使用前重蒸),柱層析硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)的200～300目硅膠H,薄層層析硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)的硅膠HF254,其它均為市售(AR.)試劑。1.2病毒海洋真菌4454號分離自香港紅樹林,無孢子生成,種屬未定。1.3水調(diào)ph培養(yǎng)基:葡萄糖10g,蛋白胨2g,酵母膏1g,粗海鹽3.5g,自來水1L,調(diào)pH7.0。110L培養(yǎng)基分裝500mL三角瓶,每瓶裝培養(yǎng)基200mL,1.25×105Pa滅菌15min,冷卻后接種,在25℃采用間歇式搖瓶培養(yǎng)32～36d。1.4l乙醇破乳萃取發(fā)酵總物呈膠凍狀,用紗布過濾得發(fā)酵液,發(fā)酵液50℃減壓濃縮至約5L,用等體積乙酸乙酯萃取2次;膠凍狀菌絲體用50L乙醇破乳,紗布過濾得到的濾液于50℃減壓回收乙醇后用等體積乙酸乙酯萃取2次。所有乙酸乙酯萃取液合并,于50℃減壓回收溶劑,得發(fā)酵液粗提物約18.4g,粗提物硅膠拌樣,經(jīng)硅膠柱層析,石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫后再用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫,反復(fù)硅膠柱層析,重結(jié)晶純化,分別得到化合物A(20mg),B(50mg)和C(30mg)。1.5一般化合物的實驗數(shù)據(jù)(1)mso-d6黃色固體,mp>300℃,FABMS(m/z):113[M+H]+;1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.89(brs,1H,NH),10.70(brs,1H,NH),7.35(d,8.5Hz,1H),5.43(dd,8.5,6.0Hz,1H);13CNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:164.8(s),152.0(s),142.6(d),100.7(d)。(2)d,5.0h,2h,2h,2h無色針狀晶體,mp166～168℃,1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:4.33(d,5.0Hz,2H),4.24(t,6.0Hz,2H),4.07(d,7.0Hz,2H),3.60(m,2H),3.55(t,7.5Hz,2H),3.46(m,2H),3.38(m,2H)。(3)化合物c無色塊狀晶體,mp190～192℃,1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.62(brs)。2化合物的鑒定化合物A的FABMS譜在m/z113給出分子離子峰[M+H]+,1HNMR給出4個質(zhì)子信號,13CNMR和DEPT譜給出4個碳信號,其中2個季碳和2個CH。這些信息提示其分子式為C4H4N2O2,計算不飽和度為4。氫譜中δ10.89(brs,1H,NH)和10.70(brs,1H,NH)為2個酰胺質(zhì)子信號,δ7.35(d,8.5Hz,1H)和5.43(dd,8.5,6.0Hz,1H)為雙鍵質(zhì)子信號;13CNMR中δ164.8(s)和152.0(s)為酰胺羰基碳信號,δ142.6(d)和100.7(d)為雙鍵碳信號。根據(jù)這些信息推斷該化合物為尿嘧啶。進(jìn)一步對比文獻(xiàn)值和標(biāo)準(zhǔn)物譜圖得到證實?；衔顱為無色針狀晶體,難溶于乙酸乙酯、甲醇、石油醚等有機(jī)溶劑,易溶于熱水,能燃燒。硅膠TLC展開碘熏不顯色,紫外燈照也不發(fā)熒光。測其熔點為166～168℃。這些信息初步提示可能為甘露醇。氫譜顯示多個連氧質(zhì)子信號和羥基質(zhì)子信號,其中在δ4.33(d,5.0Hz,2H),4.07(d,7.0Hz,2H)的信號為仲醇羥基質(zhì)子信號,在δ4.24(t,6.0Hz,2H)的信號為伯醇羥基質(zhì)子信號,而在δ3.60(m,2H),3.55(t,7.5Hz,2H),3.46(m,2H)和3.38(m,2H)的信號為連羥基CH或CH2質(zhì)子信號。這些特征與已知物甘露醇的氫譜特征一致,進(jìn)一步與文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)物的氫譜對照鑒定該化合物為甘露醇。化合物C為無色晶體,熔點為190～192℃,硅膠TLC展開紫外燈照不顯色,碘熏則顯白色,拖長尾,其氫譜很簡單,只在δ12.12出現(xiàn)一個羧基活潑氫的寬單峰質(zhì)子信號,因而很容易推斷該化合物為草酸。甘露醇是一種在自然界廣泛存在的化合物,最早發(fā)現(xiàn)存在于南瓜、蘑菇、洋蔥以及褐海藻中。1806年P(guān)roust首先從甘露蜜樹(mannaash)中分離得到,故而得名。甘露醇具有鎮(zhèn)咳、祛痰、擴(kuò)張支氣管和增強(qiáng)腎上腺素的作用,因而在醫(yī)藥上用途廣泛,同時也廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)和其它工業(yè)。特別是它還是制造藥物的重要原料,目前它仍然是抗癌藥物、抗生素、心血管用藥物的原料。最近,我國生產(chǎn)的去氧甘露醇就是良好的抗癌藥物。由于甘露醇用途如此廣泛,特別是最近開辟了在口香糖方面的用途,所以其需求量迅速增長,因而人們在研究各種方法以提高它的產(chǎn)量。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法如天然提取法,成本過高,化學(xué)法轉(zhuǎn)化率低