代謝組學(xué)視角下中醫(yī)證候研究的新突破

代謝組學(xué)視角下中醫(yī)證候研究的新突破

中醫(yī)證候是中醫(yī)整體觀和辨證論治觀的體現(xiàn)。中醫(yī)證候的研究是中醫(yī)基礎(chǔ)研究的一個重要科學(xué)問題。作為系統(tǒng)生物學(xué)的代謝組學(xué)是多層次、多靶點研究表達(dá)集體的功能狀態(tài),以及通過代謝輪廓代謝指紋的變化表達(dá)外源性擾動帶來的功能改變,其無歧視的整體性、動態(tài)的功能性,與中醫(yī)證候?qū)Σ±頎顟B(tài)的整體表述的理念相吻合,引入代謝組學(xué)的理念和方法,不僅有助于探索中醫(yī)證候的本質(zhì),更有益于推進(jìn)基于證候的中藥創(chuàng)新藥物的研究。本文綜述了近年來中醫(yī)證候的研究和基于代謝組學(xué)的中醫(yī)證候本質(zhì)研究的相關(guān)文獻(xiàn),以期對證候研究及中醫(yī)藥的相關(guān)研究有所幫助。一、中醫(yī)證候辨證標(biāo)準(zhǔn)的建立和完善為中醫(yī)證候是中醫(yī)關(guān)于人體在疾病狀態(tài)下信息的綜合征象,是對人體在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中某一時段生理、病理狀態(tài)的概括,是中醫(yī)學(xué)辨證論治的基礎(chǔ)。中醫(yī)認(rèn)為“視其外應(yīng),以知其內(nèi)臟,則知所病矣”、“有諸內(nèi)必形諸外”,即疾病在體內(nèi)的病理變化,必定在體表找到其可征之候,出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀。因此證候是中醫(yī)辨證論治和整體觀的集中體現(xiàn)。近年來中醫(yī)證候的研究主要包括辨證標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一、證候動物模型的建立等有關(guān)證候本質(zhì)的探索工作。目前中醫(yī)證候辨證標(biāo)準(zhǔn)的建立方法為首先獲取辨證信息,然后通過數(shù)理統(tǒng)計或?qū)I(yè)知識判斷等方法建立辨證標(biāo)準(zhǔn),最后檢驗辨證標(biāo)準(zhǔn)。證候辨證標(biāo)準(zhǔn)的建立盡管在研究方法上取得了顯著進(jìn)展,但未有實質(zhì)性突破。單純應(yīng)用數(shù)理統(tǒng)計方法偏離了中醫(yī)藥理論復(fù)雜體系,而用專家判斷的方法也沒有擺脫統(tǒng)計指標(biāo)的局限,盡管在一定程度上表述了辨證標(biāo)準(zhǔn)的客觀化,并未挖掘出證候的內(nèi)在信息。中醫(yī)證候動物模型的建立主要分兩個方面:一是根據(jù)中醫(yī)理論病因病機(jī)模擬造模;二是由藥物(中藥或化學(xué)藥物)直接誘導(dǎo)疾病造模。根據(jù)動物的病理表現(xiàn),結(jié)合證的客觀指標(biāo),加之以方藥測證等方法來確定證候造模是否成功。這兩種方法都囿于動物不能表述其病理感受,不能通過四診綜合判斷證候,證候的內(nèi)在綜合信息又缺少反映的方式和方法,造模是否和證候直接關(guān)聯(lián)難以評價,造模方法的科學(xué)性問題尚在探討之中。以往對于中醫(yī)證候本質(zhì)的研究是一直是按照西醫(yī)的還原論思維方法,從整體到器官、組織、細(xì)胞,不斷細(xì)分到分子生物學(xué),試圖找到能夠評價證候的生化指標(biāo)。但是,中醫(yī)治病與西醫(yī)拮抗特定的疾病靶點的治療方法不同,是通過調(diào)整機(jī)體的整體功能狀態(tài),使恢復(fù)人體原本的系統(tǒng)平衡狀態(tài)。中醫(yī)證候不僅僅是幾個癥狀和體征的簡單相加,而且是一組綜合的證候群,是對病因、病性、邪正盛衰等疾病本質(zhì)的集中概括,單純以還原論方法將其研究不斷細(xì)化不足以表征證候本質(zhì)。二、代謝組學(xué)的現(xiàn)代發(fā)展代謝組學(xué)(Metabonomics/Metabolomics)是定量研究有機(jī)體對由病理生理刺激或遺傳變異引起的、與時間相關(guān)的多參數(shù)代謝應(yīng)答,是Nicholson等在長期應(yīng)用1H-NMR方法研究生物體液、細(xì)胞、組織中的多成分代謝的基礎(chǔ)上提出的。代謝組學(xué)的主要研究對象是小分子的代謝產(chǎn)物,樣品主要有尿液、血漿或血清、唾液,以及細(xì)胞和組織的提取液。通過對生物體液和組織進(jìn)行系統(tǒng)測量和分析,對完整的生物體(而不是單個細(xì)胞)中隨時間改變的代謝物進(jìn)行動態(tài)跟蹤檢測、定量和分類,并與病理生理過程中的生物化學(xué)和生理學(xué)改變關(guān)聯(lián)起來,確定發(fā)生這些變化的靶器官和作用位點,進(jìn)而確定相關(guān)的生物標(biāo)志物。目前代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于藥物安全性評價、疾病診斷、藥效評價等方面。完整的代謝組學(xué)分析的流程包括樣品的采集和預(yù)處理、數(shù)據(jù)的采集和數(shù)據(jù)的分析及解釋。目前代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)采集技術(shù)主要有色譜、質(zhì)譜、核磁共振技術(shù)及液-質(zhì)聯(lián)用和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等。色譜具有高分離度、高通量的特點;質(zhì)譜有很強(qiáng)的普適性、高靈敏度和特異性;核磁共振技術(shù)能夠?qū)悠穼崿F(xiàn)非破壞性、非選擇性的分析且1H-NMR對含氫代謝產(chǎn)物有普適性,是當(dāng)前代謝組學(xué)研究中的主要技術(shù)。但其樣品制備的要求高,動態(tài)范圍有限,很難同時測定生物體系中共存濃度相差較大的代謝產(chǎn)物,所需硬件的投資也較大。而各種譜學(xué)技術(shù)結(jié)合的方法,能夠保證盡可能精確地分析生物體系中盡量多的代謝組分,使得整個分析過程盡可能多的保留樣品中代謝物的整體信息,是今后代謝組學(xué)分析技術(shù)發(fā)展的必然趨勢。數(shù)據(jù)分析技術(shù)主要是利用模式識別對采集的信息進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)處理,分為監(jiān)督型和監(jiān)督型方法,前者有主成分分析(PCA)、非線性映射(NLM)、聚類分析(CA)等,后者包括人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)等,最終要建立可利用的相關(guān)數(shù)據(jù)庫及專家系統(tǒng),如倫敦大學(xué)的皇家科學(xué)院實驗室和Pfizer等6家制藥公司2001年啟動的藥物毒性研究小組(COMET)初步建立的“CLOUDS”系統(tǒng)。陳竺認(rèn)為到了系統(tǒng)生物學(xué)的時代,強(qiáng)調(diào)整體論的中醫(yī)和強(qiáng)調(diào)還原論的西醫(yī)找到了共同語言。而作為系統(tǒng)生物學(xué)重要組成部分的代謝組學(xué)應(yīng)當(dāng)成為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重要技術(shù)與方法。劉昌孝認(rèn)為中醫(yī)診治的準(zhǔn)確性很大程度上依賴醫(yī)生的診療經(jīng)驗。而代謝組學(xué)具備反映和詮釋這些問題的“組”、“群”、“譜”集成的分析功能,它能夠通過檢測不同時間患者的尿液或血液,對這些代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析,可以提高診治的科學(xué)化、定量化,避免人為因素的誤診。利用代謝組學(xué)研究中醫(yī)證候擺脫了西方還原論的束縛,從整體層面分析中醫(yī)證候的特點,反映中醫(yī)證候的內(nèi)涵,高通量及無歧視的成分分析能夠快速解決中醫(yī)證候主觀對信息的歧視的問題,使中醫(yī)證候本質(zhì)客觀化。三、基于代謝研究的中醫(yī)證候研究1.潛在生物標(biāo)記物通過建立中醫(yī)證候的動物模型,分析其生物樣本,進(jìn)行代謝組學(xué)研究,找到中醫(yī)證候的生物標(biāo)記物,有利于進(jìn)一步闡明中醫(yī)證候的本質(zhì)并應(yīng)用于臨床診斷和治療。PingWang等利用UPLCHDMS對大鼠腎陰虛證模型進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。灌胃給予甲狀腺素和利血平造成大鼠腎陰虛證模型,檢測尿液代謝輪廓,主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn)腎陰虛證組與空白組有顯著性差異,并結(jié)合正交偏最小二乘判別分析方法(O-PLS-DA)找到20個離子作為腎陰虛證的潛在生物標(biāo)記物,這些物質(zhì)與色氨酸、賴氨酸、嘌呤、嘧啶、三羧酸循環(huán)等代謝通路有關(guān)。給予六味地黃丸后使上述潛在標(biāo)記物的代謝輪廓回調(diào)至正常動物水平。XinjieZhao等用UPLCQ-TOF/MS對大鼠血瘀證模型進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。注射腎上腺素鹽酸鹽、并浸入冰水,致大鼠血瘀證模型。經(jīng)PCA分析得模型組與空白組尿液代謝輪廓有顯著性差異,偏最小二乘法判別分析(PLSDA)分析找到7個可作為血瘀證潛在生物標(biāo)記物:膽汁酸、二羥基膽烷酸、苯丙氨酸、犬尿喹酸、色氨酸、精氨酸、N-2-琥珀酰-鳥氨酸。推測這些標(biāo)記物與體內(nèi)苯丙氨酸、5-羥色氨生物的代謝通路有關(guān),能夠影響NO的合成路徑進(jìn)而影響心血管系統(tǒng)的功能。模型組給予不同劑量的新迪軟膠囊后,尿液代謝輪廓介于空白組與模型組之間,有回調(diào)至空白組水平的趨勢,且高中劑量組較低劑量組的代謝輪廓更接近空白組。羅和古等利用1H-NMR對大鼠肝郁脾虛證模型進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。用慢性束縛法致大鼠肝郁脾虛證模型后,PCA分析大鼠血漿代謝譜發(fā)現(xiàn)了5個可作為肝郁脾虛證的生物標(biāo)志物,包括醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和3.44ppm的未知化合物。上述內(nèi)源性代謝物的改變提示動物能量代謝及脂肪、蛋白質(zhì)代謝功能異常,這與已知的應(yīng)激態(tài)動物體內(nèi)代謝的調(diào)節(jié)過程及結(jié)果相一致。姜春燕等利用UPLCTOF/MS對大鼠腎陽虛證模型進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。臀部肌肉注射糖皮質(zhì)激素氫化可的松琥珀酸鈉造成腎陽虛證模型后,首先觀察大鼠行為狀態(tài)變化,并以血清促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(COR)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)為客觀指標(biāo),且通過灌胃白附片溶液反證3個方面共識確定為腎陽虛證模型。OPLS分析血漿內(nèi)源性代謝物發(fā)現(xiàn)了3個腎陽虛證的生物標(biāo)記物,分別為溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)和468.4m/z的未知化合物,推測LPE、LPC的改變可能與造模引起的肝損傷有關(guān)。張惠云等利用UPLCTOF/MS對大鼠經(jīng)前期綜合征肝氣逆證模型進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。用電刺激法復(fù)制經(jīng)前期綜合征肝氣逆證大鼠模型,檢測各組大鼠尿液的代謝指紋變化,對照組、造模組得到較好的區(qū)分,給予白香丹膠囊后代謝網(wǎng)絡(luò)有修復(fù)趨勢。分析表征14個潛在生物標(biāo)記物,包括甲基鳥嘌呤、2,3-二羥基-3-甲基戊酸、D-半乳糖胺、5-氨基戊酸、2-氨基己二酸、D-脯氨酸、褪黑激素、3羥基丙酮酸-5-羧基、4-羥基谷氨酸、2,3-二氫甲基砒啶酸、去氧腺苷、5,7,4’-三羥基異黃酮、癸二酸、前列腺素F2α。其中2-氨基己二酸、褪黑激素、4-羥基谷氨酸參與了與情緒活動密切相關(guān)的代謝途徑;5,7,4’-三羥基異黃酮與調(diào)節(jié)經(jīng)前期癥狀關(guān)系密切;前列腺素F2α與影響月經(jīng)周期有關(guān)。進(jìn)行中醫(yī)證候動物模型的代謝組學(xué)研究,有助于探討中醫(yī)證候產(chǎn)生的病理機(jī)制,對證候動物模型也起客觀評價作用。但是建立能夠完全體現(xiàn)中醫(yī)理論和證候特點的動物模型非常困難,并且由于動物與人存在生理差異,研究結(jié)果能否應(yīng)用于臨床還值得探討。2.血漿及中醫(yī)分型選擇臨床同一疾病的患者進(jìn)行辨證分型,進(jìn)行各個證型的代謝組學(xué)研究即同病異證的研究。同病異證是中醫(yī)證候在同一疾病中的體現(xiàn),是中西醫(yī)結(jié)合研究的重要環(huán)節(jié)。目前研究較多的有冠心病、腎病、高血壓、糖尿病等。由于這類疾病發(fā)病率高、持續(xù)時間長、死亡率高,且化學(xué)藥物治療效果不好,采用中醫(yī)藥治療時就需要對患者的癥狀進(jìn)行辨證分型,因此中醫(yī)證候辨證標(biāo)準(zhǔn)亟待建立。而利用代謝組學(xué)技術(shù)研究中醫(yī)證候,找到表征其病理狀態(tài)的生物標(biāo)記物有助于提高中醫(yī)藥臨床治療效果。XintianZheng等利用GC-MS對冠心病心氣虛證和心血瘀證患者血漿中脂肪酸進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。選擇25例健康者和23例冠心病患者,患者根據(jù)癥狀分為心氣虛和心血瘀兩個群組。利用模式識別方法分析血漿中脂肪酸代謝輪廓,能夠明顯區(qū)別兩種證候,找到的潛在生物標(biāo)記物有飽和脂肪酸、N-3多不飽和脂肪酸、N-6多不飽和脂肪酸、反式脂肪酸等。推測其作用機(jī)制可能為:高濃度的N-6和代低濃度的N-3對心血瘀證和心氣虛證有很大影響,可能致動脈粥樣硬化,最后致血瘀證候;也可降低心肌耐缺氧能力和心輸出量,引起胸悶、心悸、氣短、和心氣虛證的體力不支癥狀。董飛俠等利用GC-MS對慢性腎病Ⅲ期患者尿液進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。選擇慢性腎病Ⅲ期患者60例(其中腎陽虛者30例,非腎陽虛者30例)及體檢健康志愿者30例,經(jīng)PCA和OPLS-DA分析能夠很好區(qū)分腎陽虛和非腎陽虛兩組病人,差異代謝物的關(guān)鍵成分是丙氨酸、胺基丙二酸二乙酯、脯氨酸、檸檬酸、馬尿酸和組胺等,這些成分與能量代謝,精氨酸和脯氨酸代謝,組氨酸代謝途徑相關(guān)。王廣基等利用GC-TOF/MS對冠心病中醫(yī)分型進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。選擇43例冠心病患者分為痰阻心脈證(29例)和氣陰兩虛證(14例),健康志愿者27例作為對照組。分析發(fā)現(xiàn)痰阻心脈患者血漿軟脂酸、脯氨酸、門冬氨酸、油酸、谷氨酸、苯丙氨酸和尿酸顯著高于健康對照組;而次黃嘌呤和4-羥基苯甲酸顯著低于健康對照組。氣陰兩虛患者血漿琥珀酸、門冬氨酸、3-羥基丁酸、油酸、軟脂酸、硬脂酸、脯氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸顯著高于健康對照組;而天(門)冬酰胺、色氨酸、次黃嘌呤和4-羥基苯甲酸顯著低于健康對照組。兩證型間多個內(nèi)源性代謝物的含量存在明顯差異并與能量代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝異常相關(guān)。利用臨床同病異證進(jìn)行代謝組學(xué)研究,避免了動物模型與人體生理病理狀態(tài)的差異,研究結(jié)果可以直接應(yīng)用于臨床實踐。三、高血壓的治療目前代謝組學(xué)在中醫(yī)藥研究中應(yīng)用日趨廣泛而深入,但代謝組學(xué)研究自身具有復(fù)雜性,且整體上仍處于發(fā)展階段,受到個體差異、內(nèi)外源性物質(zhì)擾動與數(shù)據(jù)挖掘及信息處理技術(shù)的局限。如陸益紅等將原發(fā)性高血壓患者辨證分為肝火亢盛、痰濕壅盛及陰虛陽亢三型,應(yīng)用GC/MS測定健康人及患者血清內(nèi)源性代謝物,分析表明利用PCA和PLS—DA不能將高血壓的3個證型完全分開,而馬氏距離分析(MD)不僅可以清晰地區(qū)分上述3種類型的高血壓,同時還顯示高血壓的發(fā)展過程。高崗等進(jìn)行了腎虛證代謝組學(xué)及六味地黃湯的干預(yù)研究。他們分別應(yīng)用NMR,LC-MSn,LC-TOF/MS,GC-MS對大鼠尿液和血漿樣品進(jìn)行分析,結(jié)果顯示用不同分析方法找到的標(biāo)記物不相同。說明單純用一種分析儀器或方法,只能給出代謝產(chǎn)物的部分信息,因此結(jié)合多種分析和技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)研究是必要