正常生活狀態(tài)下大鼠腦內全腦內c

正常生活狀態(tài)下大鼠腦內全腦內c

c-fos基因家族是c-fos、fos-b、fra-1和fra-2的立即早期基因。此家族的基因特別是c-fosmRNA及其表達產物FOS蛋白被用作神經元功能活動標記物已被廣泛應用且日臻成熟。許多作者應用這一指標研究各種刺激誘導下的中樞神經元的功能活動狀態(tài),獲得了大量有價值的資料。但是本文作者等的研究發(fā)現(xiàn),在未給予任何特異性的實驗性刺激時,腦內一些部位的神經元也有較強的恒定的FOS表達,這往往成為混淆實驗結果分析的因素之一。全面了解在正常生活狀態(tài)下的動物腦內FOS的基礎表達,對了解與動物基礎代謝和生理活動相關的核團以及正確分析各種實驗結果有重要的意義。迄今尚未見對此做深入系統(tǒng)的報道,腦內哪些核團有較強的基礎FOS表達還未見報道。因此,本研究用正常生活狀態(tài)下的大鼠對此問題進行了系統(tǒng)研究,并以福爾馬林試驗作為對照。材料和方法1.小鼠腦損傷和大鼠腦總酸ld50雄性SD大鼠12只,體重180～250g,在溫暖、自然光線、水和食物充足、相對安靜并且可自由活動的環(huán)境中飼養(yǎng)一周。隨機分為2組:無實驗性刺激組6只,疼痛刺激組6只。每組動物分兩籠飼養(yǎng),每籠3只,以避免同籠動物數(shù)量過多,造成抓取動物時對其它動物的干擾。每天下午2～5h進行抓摸訓練,以使動物適應給藥時的抓摸刺激。取材時間為下午2～5h,同籠中3只動物在5min內先后麻醉。無刺激組在未給予任何實驗性刺激的狀態(tài)下,迅速給予1%戊巴比妥鈉(80mg/kg)腹腔內注射,麻醉后開胸,經心臟灌注,先用生理鹽水100ml沖凈血液,然后用預冷的4%多聚甲醛固定液400ml灌注,先快灌200ml,繼之慢灌200ml。待固定液滴注完畢,取腦,用4%多聚甲醛后固定2h,再將腦組織塊放入含20%蔗糖磷緩液,4℃過夜。組織塊完全沉底后用冰凍切片機連續(xù)冠狀切片,每5張取一張,片厚50μm。疼痛刺激組在麻醉狀態(tài)下向右上唇注射5%甲醛溶液50μl,存活2h后麻醉取材,余同無刺激組。2.tri頓x-100封閉先將切片經0.01mol/LPBS漂洗5min×3次后,浸入80%甲醇和0.3%過氧化氫封閉30min,0.01mol/LPBS漂洗10min×3次,再用1%牛血清白蛋白、3%羊血清和0.3%TritonX-100封閉1h。同前漂洗之后,用ABC方法進行免疫組化反應:首先將漂片浸入兔抗FOS抗體(1∶3000,SantaCruz),室溫孵育36h;0.01mol/LPBS漂洗10min×3次;入生物素化的抗兔二抗,室溫4h;0.01mol/LPBS漂洗10min×3次;最后入生物素-卵白素-辣根過氧化物酶復合物(ABC,1∶500,Sigma公司),室溫2h,0.01mol/LPBS漂洗10min×3次。用硫酸鎳銨DAB藍色反應法進行呈色反應,當陽性產物呈深藍色而背底幾乎無色時終止反應,貼片,梯度脫水、透明、封片,光鏡下觀察。電生理檢查fos陽性神經元的表達對無實驗性刺激組從延髓尾端到端腦的全腦切片進行了觀察。FOS樣免疫反應陽性神經元出現(xiàn)在非常廣泛的腦區(qū),在所觀察的6例動物中,FOS陽性細胞的分布模式都非常相似。其中4例較強,2例略弱。出現(xiàn)FOS陽性神經元的核團分為三種情況(Figs.1～6):(1)出現(xiàn)較多FOS陽性神經元的核團;如:孤束核的連合部和內側部,腦橋核,下丘,丘腦的室旁核,下丘腦的乳頭體上核、視交叉上核,中央杏仁核,新皮質等;(2)出現(xiàn)中等量FOS陽性神經元的核團,如:三叉神經脊束核尾側亞核(三叉神經感覺核團其它亞核幾無陽性反應),A1區(qū)、舌下神經前置核,中央灰質腹外側部,下丘腦后區(qū),外側膝狀體腹側核,視上核,扣帶回皮質,等;(3)出現(xiàn)少量FOS陽性神經元的核團,如:最后區(qū),前庭內側核,中縫蒼白核,中縫大核,耳蝸背側核,外側丘系核,藍斑,A5區(qū),A7區(qū),面神經膝上核,上丘,E-W核,丘腦板內核群,海馬錐體層,下丘腦弓狀核及背內側核、室旁核杏仁內側核,視前內側區(qū),嗅結節(jié),終紋床核等(詳細內容見附表)。在陽性細胞較少的兩例,上述一、二類核團中都有陽性細胞,只是數(shù)量略少,而在第三種核團內則偶見。口周注射甲醛的疼痛刺激組與無實驗性刺激組相比,在部分核團內的FOS表達出現(xiàn)特征性變化。如在實驗側三叉神經脊束核尾側亞核的Ⅰ、Ⅱ層內FOS陽性神經元數(shù)量顯著增多(Figs.7,8),而Ⅲ、Ⅳ層較正常動物減少。在下丘腦室旁核內側小細胞部也出現(xiàn)大量的FOS陽性神經元。但疼痛刺激組的腦內大部分核團,標記細胞的數(shù)量和分布模式與正常無實驗刺激組相比無明顯變化。在丘腦腹后內側核內也未發(fā)現(xiàn)FOS表達。動物腦區(qū)fos表達狀態(tài)c-fos原癌基因是即刻早期基因中的一種,對神經遞質、激素、神經沖動等外界刺激的傳入信息在數(shù)分鐘內即可迅速作出反應、進行表達。正常的原癌基因及其蛋白產物對細胞的生長、分化和功能活動至關重要。在包括神經元在內的絕大多數(shù)正常細胞中c-fos也有低水平的表達,其轉錄激活在5min內即可發(fā)生;FOS蛋白一般在刺激后20～30min即可檢出,60～90min達高峰,可持續(xù)2～5h。當機體接受外界刺激時,c-fos和c-jun(即刻早期基因之一)被快速誘導轉錄,翻譯出的FOS和JUN迅速進入核內,組成異源二聚體FOS-JUN復合物或同源二聚體JUN-JUN,與靶基因的調節(jié)區(qū)即蛋白激活子-1(AP-1)結合,誘導靶基因的基本轉錄和刺激后轉錄,從而把外界信號與基因表型的改變耦聯(lián)起來。c-fos原癌基因是刺激激活神經元的第二信使與目的基因表達間的信息傳遞中介物,因此它又被稱為神經元的一種“第三信使”。本研究發(fā)現(xiàn),在未刺激組非常廣泛的腦區(qū)有FOS表達。本研究從抓取和麻醉到固定液開始滴灌,均在數(shù)分鐘內完成,而刺激誘導FOS表達的上調,需在20min以后,因而本實驗發(fā)現(xiàn)的這些FOS表達不可能歸因于麻醉過程所誘發(fā),而與機體的基礎代謝和日?；顒酉嚓P。動物機體存在著晝夜節(jié)律,體內的激素水平發(fā)生著節(jié)律性的變化;機體不斷地進行新陳代謝,也可導致激素和神經遞質釋放水平的改變;同時,動物總是不可避免地受到外界光線、聲音及其它的刺激,個體之間也在不斷發(fā)生著信息傳遞。所有這些,都可對動物構成刺激,激活第二信使,并進而導致c-fos基因的表達。因此,動物在未接受實驗性刺激時,在其腦內與這些功能活動有關的核團FOS表達也應該是存在的,而且也應該是存在節(jié)律性改變。因而在本實驗中,動物腦區(qū)存在著廣泛的FOS表達是可以理解的。了解動物無實驗性刺激狀態(tài)下的腦內FOS表達狀態(tài),無疑地對在各種實驗刺激條件下FOS表達結果的分析具有重要意義。在分析一些基礎FOS表達較強的核團如孤束核、臂旁外側核、下丘、丘腦室旁核、杏仁中央核等核團時尤應謹慎。如孤束核接受某種實驗刺激之后僅發(fā)現(xiàn)FOS陽性細胞有輕度增加時,則不能把所有FOS陽性神經元都歸諸于這種刺激的影響而不考慮基礎表達的狀態(tài),否則必將導致錯誤的結論。因而,嚴格、謹慎地設置對照組及科學地進行統(tǒng)計學分析極其重要。同時,刺激強度和性質的改變,以及取材時間的不同也都可以影響第一信使物質的量,也可影響FOS的表達量。譬如同樣的束縛與制動,有的報道在杏仁中央核中出現(xiàn)FOS改變,而有的報道則相反;海馬齒狀回的基礎FOS表達高峰時間在20∶00h,而最低時間在12∶00h。除此之外,腦內其它核團也有相似的或相反的時間表達規(guī)律,對于這些因素在進行實驗設計時都應予以考慮。也應考慮c-fos以外還存在其它“第三信使”,c-fos僅是百余種即刻早期基因中的一種。本實驗結果提示,口周給予甲醛刺激后,有的核團出現(xiàn)特征性的FOS表達變化,而大部分核團則無明顯變化。本文作者等在研究免疫激發(fā)的實驗中,無論在實驗組還是對照組,也在本文觀察到的絕大多數(shù)核團內見到FOS表達。這一方面說明了FOS對于某些刺激或腦內某些核團的功能變化是一種很好的觀察指標;另一方面提示對腦內大部分FOS表達未見明顯的量的變化的核團,解釋其結果時也需要謹慎。另外,FOS指標并非適合于任何刺激和腦內核團的功能學變化的觀察,因為某些細胞(包括神經元在內)針對某些特異性刺激的功能活動的信使物質也可能是c-fos之外的其它“第三信使”。傳統(tǒng)的生理學結果都表明丘腦腹后內側核與傷害性刺激的傳遞有關,但給予疼痛刺激后此核卻不出現(xiàn)FOS表達。因而,有時僅依賴單一即刻早期基因表達作為細胞活動的功能性指標則易誤導結論,若輔以其他種類即刻早期基因,比如Egr-1、c-jun等,證據(jù)就可能更為可靠。本研究的結果提示,在進行利用FOS作標記物的實驗中應注意:(1)在處死動物時,盡可能地選擇在同一時間點內,避免晝夜節(jié)律等實驗條件以外的狀態(tài)對FOS表達產生的影響;(2)實驗刺激的強度及性質應該相等,具有可比性,持續(xù)時間也應一致。FOS表達在60～90min達高峰,持續(xù)2～5h,因此應掌握好取材時間點;(3)動物在處死前的環(huán)境應盡可能排除實驗因素以外的干擾,同時,應給予