課件-dna重組技術(shù)

第六章重組DNA技術(shù)的操作ADNA的體外重組（切、接）B用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞C重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增）D轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）第六章重組DNA技術(shù)的操作ADNA的體外重組（切、接第六章重組DNA技術(shù)的操作過程切接轉(zhuǎn)增檢第六章重組DNA技術(shù)的操作過程切接轉(zhuǎn)增檢一DNA的體外重組（切與接）第六章重組DNA技術(shù)的操作過程同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接不同粘性末端的連接粘性末端的更換人工粘性末端的連接重組率一DNA的體外重組（切與接）第六章重組DNA技術(shù)外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術(shù)，主要是依賴于核酸內(nèi)切限制酶和DNA連接酶的作用。一般說來在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)程序時(shí)，需要考慮到下列三個(gè)因素：(1)實(shí)驗(yàn)步驟要盡可能地簡(jiǎn)單易行，(2)連接形成的“接點(diǎn)”序列，應(yīng)能被一定的核酸內(nèi)切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段，(3)對(duì)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不發(fā)生干擾。

外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術(shù)F重組率重組率的定義重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25-75%重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡(jiǎn)化DNA重組的后續(xù)操作。F重組率重組率的定義重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)F重組率提高重組率的方法提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)：

5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

p5'

GCTTAAOH

5'5'

AATTCG5'

HO退火5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO堿性磷酸單酯酶堿性磷酸單酯酶F重組率提高重組率的方法提高外源DNA片段與載體的分子比：5二用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞各種基因工程受體的特性實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件二用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞各種基因工程受體的特性實(shí)驗(yàn)

一、宿主的選擇從安全性考試，應(yīng)具備以下條件：1.不適合在人體內(nèi)生存2.不適合在非培養(yǎng)條件下生存3.在非培養(yǎng)條件下，其DNA容易解體4.它的DNA不易轉(zhuǎn)移5.它的質(zhì)粒只在這一宿主由復(fù)制6.便于檢測(cè)

A受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件一、宿主的選擇A受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件從遺傳性考慮：1.重組缺陷型recA－，用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞（recA-）

2.限制系統(tǒng)的缺陷，或是修飾系統(tǒng)的缺陷。避免對(duì)外源DNA的除解。外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）

3.與重組質(zhì)粒的遺傳性狀要有顯的差異（具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型）4.具有較高的轉(zhuǎn)化效率A受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件從遺傳性考慮：A受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件B各種基因工程受體的特性大腸桿菌遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，重組子穩(wěn)定適用于外源DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素B各種基因工程受體的特性大腸桿菌遺傳背景清B各種基因工程受體的特性枯草桿菌遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全，生長迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，不產(chǎn)內(nèi)毒素適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備B各種基因工程受體的特性枯草桿菌遺傳背景清B各種基因工程受體的特性鏈霉菌抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳相對(duì)操作簡(jiǎn)便，不產(chǎn)內(nèi)毒素主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良遺傳不穩(wěn)定，生長相對(duì)緩慢B各種基因工程受體的特性鏈霉菌抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳B各種基因工程受體的特性酵母菌具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定適用于外源DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程重要的真核性受體菌內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高B各種基因工程受體的特性酵母菌具有真核生物B各種基因工程受體的特性昆蟲細(xì)胞（家蠶）具有真核生物的特征，外源基因表達(dá)量高，繁殖相對(duì)較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定適用于真核生物基因的高效表達(dá)

DNA重組操作系統(tǒng)欠完善B各種基因工程受體的特性昆蟲細(xì)胞（家蠶）具B各種基因工程受體的特性哺乳動(dòng)物細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO）

與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達(dá)系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng)適用于哺乳類動(dòng)物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢B各種基因工程受體的特性哺乳動(dòng)物細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞CB各種基因工程受體的特性植物細(xì)胞（擬南芥菜、煙葉）

農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞易于分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)單且成本低廉，具有光合作用適用于高等植物基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因藥物的生產(chǎn)，農(nóng)作物品質(zhì)的改良遺傳操作繁瑣B各種基因工程受體的特性植物細(xì)胞（擬南芥菜、煙葉）C實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體大腸桿菌用于接受質(zhì)粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms）

用于接受l-DNA：LE392、ED8654

酵母菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO畢赤酵母啤酒酵母C實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體大腸桿菌用于接受質(zhì)粒：C600、三重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增三重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)轉(zhuǎn)化A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)

A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體

用10ml冰冷的10mM

CaCl2溶液懸浮菌體，離心用1ml冰冷的75mM

CaCl2溶液懸浮菌體冰浴放置12-24小時(shí)，備用收集菌體A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取100ml感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50ng載體的重組冰浴放置半小時(shí)在42℃保溫2分鐘（熱脈沖）快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1-2分鐘DNA連接液，混勻加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1小時(shí)（擴(kuò)增）涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選

A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟MDNA分子

酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化

A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性細(xì)菌（A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無水無去污劑細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌的原生質(zhì)A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化取0.2-1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109個(gè)原生質(zhì)體），加入10-20mlDNA重組連接液，同時(shí)加入含有PEG1000和Ca2+的等滲溶液，混勻細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：細(xì)菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素

A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化取0.2-1A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)l噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)：

將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30℃保溫10分鐘轉(zhuǎn)染裂解：加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2小時(shí)，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)l噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)：A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)電穿孔轉(zhuǎn)化將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)電穿孔轉(zhuǎn)化將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長）B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4X1011個(gè)分子（6.02X1017/2686X660），也就是說，每3400個(gè)pUC18分子才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞另一方面，在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2X1010個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，每200個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞能接納pUC18DNA

B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的用途利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/mg載體，

經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個(gè)重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個(gè)重組克隆需要：

104/107

X10-2=0.1mg載體DNA

考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為：

0.1/20%=0.5

mg載體DNA

載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5mg），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的用途利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素載體及DNA重組分子方面：

載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí)插入片段的大小：對(duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素載體及DNA重組分子方面：載體本B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素受體細(xì)胞方面：

受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素受體細(xì)胞方面：受體細(xì)胞必B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素轉(zhuǎn)化方法方面：

受體細(xì)胞的預(yù)處理：影響最大供受體的比例：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化0.1ml感受態(tài)細(xì)胞50ngDNA

轉(zhuǎn)化方法：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化106-107/mgDNA

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化109

個(gè)原生質(zhì)體 50ngDNA

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-106/mgDNA

l-DNA轉(zhuǎn)染107-108/mgDNA

電穿孔轉(zhuǎn)化106-109/mgDNA

B轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素轉(zhuǎn)化方法方面：受體細(xì)胞的預(yù)處理：C轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：

Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的37℃培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程

l噬菌體轉(zhuǎn)染后的30℃培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作C轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化C轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增操作的目的增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定C轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增操作的目的增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量四轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)克隆DNA序列檢測(cè)外源基因產(chǎn)物檢測(cè)四轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)克隆DNA序列四轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子轉(zhuǎn)化子重組子目的重組子四轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）由于重組率和轉(zhuǎn)化率不A載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr抗藥性篩選法的基本原理：

pBR3224363bpori抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子將外源DNA片段插在EcoRI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcr將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、TcsA載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法ROPROISalIBamHA載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法抗藥性篩選法的基本操作：

先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上

在Ap平板上生長、但在Ap和Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子即為

ApAp+Tc影印挑選重組子

A載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法抗藥性篩選法的基本操作：先A載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)營養(yǎng)缺陷型篩選法營養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理：

營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，一般不能區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子

A載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)營養(yǎng)缺陷型篩選法營養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理A載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)營養(yǎng)缺陷型篩選法常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記：

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在兩條dTTP的合成途徑：用于大腸桿菌的營養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的營養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇tk-缺陷型dCDPdTDPdTTPTRdTMPdTDPdTTPAPTKAP氨基喋呤TK胸腺嘧啶核苷激酶A載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)營養(yǎng)缺陷型篩選法常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記：胸腺嘧啶核苷激酶簡(jiǎn)稱胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核細(xì)胞中都有表達(dá),是嘧啶生物合成補(bǔ)救代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,它可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為dTMP,繼續(xù)磷酸化生成dTTP,參與DNA的生物合成。胸腺嘧啶核苷激酶簡(jiǎn)稱胸苷激酶（thymidineKinas含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（tk-）不能在含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補(bǔ).TK-細(xì)胞因氨基喋呤抑制了dTTP的合成而死亡，TK+細(xì)胞可存活，以此進(jìn)行篩選.含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（tk-A載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：

顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等A載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：A載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法顯色篩選法的基本操作：

pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重組子（Apr+lacZ-）

將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標(biāo)記基因內(nèi)部，使之滅活，此時(shí)重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍(lán)色菌落A載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)顯色篩選法顯色篩選法的基本操作：pUC1B克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法所謂的限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。B克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法所謂的限制性酶切B克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分重組子與非重組子用BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA電泳觀察酶解產(chǎn)物片段重組子：2.7kb+4.0kb非重組子：2.7kb如果外源DNA片段也是2.7kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然后通過其長度來鑒定其是否為重組子B克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：pUC18B克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriSSBP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分重組子與非重組子如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位點(diǎn)處，原則上也可用SphI酶解鑒定，但這樣做很不經(jīng)濟(jì)，因?yàn)镾phI非常昂貴（每100單位50美元）。用HindIII和EcoRI聯(lián)合酶解同樣可以達(dá)到目的，但這兩種酶的價(jià)格只及SphI的1/50

B克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：pUC1B克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分目的重組子與非目的重組子用EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA目的重組子：3.0kb+3.7kb或者：1.0kb+5.7kb用PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA目的重組子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kbB克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：pUC18B克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBE4.0kb2.0kb2.0kb區(qū)分目的重組子與非目的重組子對(duì)圖示的克隆片段，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA用EcoRI酶切開后，只出現(xiàn)2.0kb和2.7kb兩條帶子，實(shí)際上2.0kb的條帶中含有兩種不同的分子2.7kb2.0kbEB克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：pUC18B克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法部分酶解圖譜法：2.2kbPstIEcoRIBamHIBBE4.4kb1.21.8kbEB0.60.8該重組質(zhì)粒經(jīng)酶解后，分別得到下列幾組數(shù)據(jù)：BamHI全酶解：0.60.85.2

kbBamHI+EcoRI全酶解：0.60.81.81.22.2

kb其中，1.2kb片段的存在表明該片段位于一端BamHI部分酶解：1.42.64.0

kb其中，1.4kb的片段必為0.6kb和0.8kb兩片段，表明兩者是連在一起的；同理，2.6kb的片段必為0.8kb和1.8kb兩片段，表明兩者是連在一起的；最后，4.0kb的片段必為0.6kb和3.4kb兩片段，表明兩者是連在一起的B克隆DNA序列檢測(cè)限制性酶切圖譜法部分酶解圖譜法：2.2B克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計(jì)并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù)B克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法菌落或噬菌斑B克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法菌落原位雜交法的基本操作：影印用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板

洗滌雜交感光用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜

用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜

80℃烘干固定影印薄膜

薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜

用X光膠片覆蓋薄膜感光

B克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法菌落原位雜交法的基本B克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法雜交探針的制備：用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件：?jiǎn)捂溄Y(jié)構(gòu)（雙鏈DNA可用堿變性）

足夠長度（至少12個(gè)堿基）內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū)

探針的制備方法或來源包括：人工合成cDNA合成

同源序列mRNA

B克隆DNA序列檢測(cè)菌落噬菌斑原位雜交法雜交探針的制備：用于B克隆DNA序列檢測(cè)DNA序列分析法雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本原理：

DNA序列測(cè)定是精確鑒定目的基因的重要手段，目前國際上流行采用Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)程中，通過位點(diǎn)特異性終止測(cè)定DNA序列其關(guān)鍵技術(shù)有：DNA鏈聚合反應(yīng)時(shí)的定點(diǎn)隨機(jī)中斷（ddNTP）聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨率（600bp/601bp）電腦自動(dòng)檢測(cè)、記錄、編輯程序用于DNA測(cè)序的專一性試劑盒（Kit）B克隆DNA序列檢測(cè)DNA序列分析法雙脫氧末端終止測(cè)序法的基

在模板指導(dǎo)下，聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延長，合成出新的互補(bǔ)的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5’-引物端和以ddNMP殘基為3’端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個(gè)核苷酸的單鏈DNA，從而讀取DNA的核苷酸序列。在模板指導(dǎo)下，聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’雙脫氧終止法測(cè)序反應(yīng)體系包括：DNA聚合酶單鏈DNA模板帶有3-OH末端的單鏈寡核苷酸引物Mg2+4種dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP)4種ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)雙脫氧終止法測(cè)序反應(yīng)體系包括：DNA聚合酶Sanger法DNA測(cè)序的試劑①引物：通常由20-23個(gè)堿基構(gòu)成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚體或形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)②模板③DNA聚合酶④2′，3′-雙脫氧核苷三磷酸（2′,3′-dideoxynucleosidetriphosphate,ddNTP）⑤dNTPSanger法DNA測(cè)序的試劑①引物：通常由20-23個(gè)堿B克隆DNA序列檢測(cè)DNA序列分析法雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本操作：

A

C

G

T

ssDNA

ssDNA

ssDNA

ssDNA

Primer

Primer

Primer

Primer

KlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddCTPddGTPddTTPA

G

T

C

DNA聚合反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳B克隆DNA序列檢測(cè)DNA序列分析法雙脫氧末端終止測(cè)序法的基C外源基因產(chǎn)物檢測(cè)蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法淀粉酶目的基因的鑒定：

淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。將難溶的淀粉加入固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基呈混濁狀。將待鑒定的重組克隆涂布在此培養(yǎng)基上，含目的基因的目的重組子可其表達(dá)的淀粉酶分泌出胞外，并均勻擴(kuò)散，同時(shí)降解淀粉為可溶性的多糖或單糖。因此，目的重組子菌落周圍會(huì)形成透明圈。如果透明圈不明顯，還可往培養(yǎng)板上噴碘，使淀粉所在區(qū)域呈藍(lán)色本底，易于辨認(rèn)。蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用類似的方法進(jìn)行鑒定C外源基因產(chǎn)物檢測(cè)蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法淀粉酶目的基因的鑒定：C外源基因產(chǎn)物檢測(cè)蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法抗菌素抗性基因的鑒定：

抗菌素抗性基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能使受體細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)該抗生素的抗性。據(jù)此，只需往培養(yǎng)板中加入適量抗生素，理論上長出的菌落即是含有目的基因的目的重組子在實(shí)際操作過程中，由于抗生素有時(shí)會(huì)誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生抗性，因此必須從抗性重