低形態(tài)學(xué)評(píng)分的d

低形態(tài)學(xué)評(píng)分的d

由于自身外受精神復(fù)制（ivf-et）技術(shù)的出現(xiàn)，決定自體外受精神復(fù)制率的重要因素是如何選擇最佳胎盤(pán)進(jìn)行移植。目前比較通用的是對(duì)不同時(shí)期的胚胎進(jìn)行分別或聯(lián)合形態(tài)學(xué)評(píng)分來(lái)選擇移植胚胎,最常用的是D3卵裂期胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)分法,但關(guān)于這種形態(tài)學(xué)評(píng)估能否反映胚胎的真實(shí)情況一直存在爭(zhēng)議。近年來(lái),在熒光原位雜交(fluorescentinsituhybridization,FISH)技術(shù)上建立的種植前遺傳學(xué)非整倍體篩查(preimplantationgeneticdiagnosis-aneuploidyscreening,PGD-AS)技術(shù)日益成熟,并逐漸開(kāi)始應(yīng)用于部分不孕人群的胚胎學(xué)分析和選擇。本研究采用FISH技術(shù)檢測(cè)D3低形態(tài)學(xué)評(píng)分胚胎的X、Y和18號(hào)染色體,探討胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估與染色體非整倍體之間的關(guān)系。1材料和方法1.1胚胎組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)收集2007年2月—2008年2月在我中心進(jìn)行IVF-ET或卵胞漿內(nèi)單精子注射患者的D3剩余廢棄胚胎。納入標(biāo)準(zhǔn):正常兩原核受精胚胎,D3形態(tài)學(xué)評(píng)分為Ⅱ+、Ⅲ、Ⅲ+或Ⅳ級(jí),細(xì)胞數(shù)≤5個(gè),不具備移植和冷凍保存價(jià)值的胚胎,經(jīng)患者簽署同意捐贈(zèng)未受精卵、精子及廢棄胚胎知情同意書(shū)后用于本研究。D3胚胎形態(tài)學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)主要參照Desai等的報(bào)道并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn),Ⅰ級(jí)為無(wú)碎片、卵裂球大小均等;Ⅰ+為碎片<10%、卵裂球大小均等,或無(wú)碎片但卵裂球大小欠均等;Ⅱ級(jí)為碎片10%~20%、卵裂球大小均等,或碎片<10%、但卵裂球大小欠均等、形狀欠規(guī)則;Ⅱ+級(jí)為碎片10%~20%、卵裂球大小欠均等或形狀欠規(guī)則;Ⅲ級(jí)為碎片21%~50%、卵裂球大小基本均等、形狀基本規(guī)則;Ⅲ+級(jí)為碎片21%~50%、卵裂球大小欠均等或形狀欠規(guī)則;Ⅳ級(jí)為碎片>51%。1.2解剖顯微觀察參照本研究組已建立的卵裂球細(xì)胞固定方法進(jìn)行胚胎的固定,具體步驟:將胚胎移入PBS緩沖液液滴中,清洗3~5次后轉(zhuǎn)移至載玻片上,加一小滴固定液(0.01N鹽酸),在解剖顯微鏡下觀察,并輕柔吹吸胚胎,直到透明帶消失、卵裂球胞漿溶解、細(xì)胞核顯露。在倒置鏡下觀察,找到細(xì)胞核的位置,用金剛石筆進(jìn)行標(biāo)記。自然風(fēng)干后于PBS中洗5min,70%、85%、100%乙醇梯度脫水,自然風(fēng)干后-20℃長(zhǎng)期保存或直接雜交。1.3dapo復(fù)染觀察采用美國(guó)Vysis公司生產(chǎn)的熒光素直接標(biāo)記的CEPX、CEPY和CEP18探針。3種探針能夠特異性與對(duì)應(yīng)染色體的著絲粒處相結(jié)合,分別標(biāo)記綠色、紅色和天藍(lán)色熒光信號(hào)。分別取1μLCEPX、CEPY及CEP18探針與1μL雙蒸水和7μL雜交緩沖液震蕩混勻后滴加到玻片上細(xì)胞核的標(biāo)記區(qū)域,蓋上蓋玻片,RubberCement封口。放入原位雜交儀中75℃變性1min,42℃雜交4h。取出玻片,移除蓋玻片,依次浸入73℃的0.4×SSC/0.3%NP-40中洗脫2min,室溫下2×SSC/0.1%NP-40中洗脫5~60s,取出載玻片,室溫下自然風(fēng)干,加入10μLDAPI復(fù)染液,蓋上蓋玻片,熒光顯微鏡下觀察。應(yīng)用熒光顯微鏡(NikonECLIPSE80i)分別于SpectrumAqua、SpectrumRed、SpectrumGreen和DAPI濾光片下行原始熒光圖像采集,用SpectraVysionCytovision染色體分析軟件(英國(guó)AppliedImaging公司)進(jìn)行熒光圖像的采集和分析。1.4以1個(gè)周同色信號(hào)的aqua濾光塊中,2個(gè)月在Green濾光塊下觀察到1個(gè)綠色信號(hào)即認(rèn)為是1條X染色體,在Red濾光塊下觀察到1個(gè)紅色信號(hào)即認(rèn)為是1條Y染色體,在Aqua濾光塊下觀察到1個(gè)天藍(lán)色信號(hào)即認(rèn)為是1條18號(hào)染色體,以此類(lèi)推。不能確定是否為1個(gè)信號(hào)時(shí),參照Munne標(biāo)準(zhǔn):以1個(gè)信號(hào)的直徑為1個(gè)域,2個(gè)同色信號(hào)距離很近或成對(duì)排列、相距在1個(gè)信號(hào)直徑以內(nèi)時(shí)計(jì)為1個(gè)信號(hào),因其多為1條染色體的DNA復(fù)制形成的姐妹染色單體或信號(hào)分裂。當(dāng)2個(gè)信號(hào)相距至少2個(gè)域以上時(shí),則認(rèn)為它們是2個(gè)不同的信號(hào)。1.5統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2熒光原位雜交分析檢測(cè)細(xì)胞中x、y和18號(hào)染色體異常率,正常細(xì)胞外共收集60個(gè)廢棄胚胎,其中正常胚胎29個(gè)(48.3%),18號(hào)染色體異常胚胎12個(gè)(20%),X/Y染色體異常胚胎8個(gè)(13.3%),18和X/Y染色體均異常胚胎11個(gè)(18.3%)。固定后得到243個(gè)核。用X、Y和18號(hào)染色體探針進(jìn)行熒光原位雜交分析,觀測(cè)到熒光信號(hào)的細(xì)胞核有233個(gè),雜交率為95.9%。有熒光信號(hào)的233個(gè)細(xì)胞核中,正常細(xì)胞核115個(gè),占49.4%,異常細(xì)胞核118個(gè)占50.6%。18號(hào)染色體異常率(40.8%)與X/Y染色體異常率(33.5%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.65,P>0.05)。其中,18號(hào)染色體三體發(fā)生率(21.9%)與X/Y染色體三體發(fā)生率(12.0%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.58,P<0.01),見(jiàn)表1和圖1~4。3體外受精原子的危險(xiǎn)D3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)主要評(píng)價(jià)細(xì)胞的數(shù)目和發(fā)育速度、細(xì)胞的均勻性及碎片數(shù)量3個(gè)方面。胚胎的卵裂球細(xì)胞數(shù)代表了胚胎的發(fā)育速度,受精后62h胚胎應(yīng)該完成第3次分裂,發(fā)育到8細(xì)胞階段。胚胎發(fā)育至4~8細(xì)胞階段時(shí),自身基因組開(kāi)始激活,因此在D2和D3存在染色體非整倍體的胚胎由于不能進(jìn)行正常的有絲分裂,出現(xiàn)各種各樣的發(fā)育異常。最常見(jiàn)的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為發(fā)育緩慢、發(fā)育阻滯或形成大量的碎片,還有的表現(xiàn)為卵裂球欠均勻、多核等。本研究中,低形態(tài)學(xué)評(píng)分的胚胎中染色體異常率達(dá)50.6%,可見(jiàn)D3形態(tài)差的胚胎有相當(dāng)大的比例存在染色體異常。本研究結(jié)果顯示18號(hào)和X/Y染色體的異常集中于三體和單體,這也是非整倍體中最常見(jiàn)的類(lèi)型。配子來(lái)源的染色體異常可能是造成胚胎發(fā)育異常的最主要因素。在減數(shù)分裂時(shí)染色體如果不分離而不能平均地分到2個(gè)子細(xì)胞內(nèi),就會(huì)生成2種配子,1個(gè)配子缺乏某1條染色體,另1個(gè)配子則相應(yīng)多了1條染色體,造成染色體數(shù)目異常,這種配子與正常配子結(jié)合時(shí),就會(huì)產(chǎn)生子代非整倍體。目前的研究認(rèn)為絕大多數(shù)非整倍體均是卵母細(xì)胞來(lái)源的,主要是2條同源染色體在卵母細(xì)胞第1次減數(shù)分裂后期不分離,同時(shí)進(jìn)入次級(jí)卵母細(xì)胞或第一極體。同理,姐妹染色單體在第2次減數(shù)分裂時(shí)不分離,同樣會(huì)造成卵子的非整倍體。此外,如果2條姐妹染色單體在第1次減數(shù)分裂后期提前分離,隨后在第2次減數(shù)分裂時(shí)隨機(jī)進(jìn)入卵子和第2極體中,也是卵子非整倍體的一個(gè)可能原因。關(guān)于同源染色體不分離、姐妹染色單體不分離或過(guò)早分離的分子遺傳學(xué)機(jī)制目前尚不清楚,但是多數(shù)研究都提示和母親的年齡高度相關(guān)。精子也可能是胚胎非整倍體的一個(gè)重要來(lái)源,筆者以往的研究顯示嚴(yán)重少弱精子癥患者的精子中非整倍體發(fā)生率為6.72%,攜帶有非整倍染色體的精子與卵母細(xì)胞受精后形成的胚胎必然產(chǎn)生非整倍體。培養(yǎng)體系和環(huán)境中的各種因素以及激素刺激方案也可能影響胚胎的細(xì)胞分裂,產(chǎn)生染色體異常。理論上某一條染色體三體和單體是由于染色體的不分離造成的,因此兩者的比例應(yīng)該接近1∶1,但是以往的研究經(jīng)常發(fā)現(xiàn)二者的比例不一致。本研究中18號(hào)染色體三體的比率略高于單體的比率,原因可能是在受精后的第1次有絲分裂中期至后期過(guò)程中,單條染色體向一極移動(dòng)時(shí)由于各種原因遲滯,從而進(jìn)入胞漿碎片中或被分解消失。具體某一條染色體是否更容易發(fā)生非整倍體并無(wú)定論。有研究認(rèn)為X/Y染色體發(fā)生非整倍體的概率比較低,18號(hào)染色體的非整倍體發(fā)生率等于或者高于X/Y染色體。本研究中18號(hào)染色體異常率(40.8%)略高于X/Y染色體異常率(33.5%),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中18號(hào)染色體和X/Y染色體的異常率均高于以往的研究報(bào)道,可能與本研究收集的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分較差有關(guān)。Eaton等研究中有來(lái)源于植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantationgenetic