鮮切果蔬上市前檢測(cè)病原微生物的應(yīng)用

鮮切果蔬上市前檢測(cè)病原微生物的應(yīng)用

隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快和生活水平的提高，人們對(duì)水果的消費(fèi)需求越來(lái)越高。新鮮食品作為一種便捷的營(yíng)養(yǎng)食物，已成為食品加工行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。鮮切果蔬(fresh-cutfruitsandvegetables)是指對(duì)新鮮果蔬進(jìn)行分級(jí)、整理、清洗、切分、保鮮、包裝等處理,并使產(chǎn)品保持生鮮狀態(tài)的制品。消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)了鮮切果蔬后無(wú)需作進(jìn)一步的處理,可直接食用或烹飪,使其具有天然、健康、方便等特點(diǎn),滿足了當(dāng)今社會(huì)生活節(jié)奏快的需求,也因此深受人們青睞。由于果蔬的含水量較高,加之切割處理降低了果蔬組織自然抵抗微生物的能力,極易引起病原微生物對(duì)鮮切果蔬的侵染,從而引起致病性疾病,危害人類(lèi)健康。據(jù)報(bào)道,在與新鮮農(nóng)產(chǎn)品有關(guān)的70多種食源性疾病中,有25%與鮮切農(nóng)產(chǎn)品有關(guān)。所以,病原微生物是影響鮮切果蔬安全的主要因素之一。本文就近幾年來(lái)鮮切果蔬病原微生物種類(lèi)、生長(zhǎng)特點(diǎn)、影響因素及快速檢測(cè)方法作一概述。1食源性微生物的寄生蟲(chóng)1.1鮮切貯藏保鮮大腸桿菌O157∶H7是一種低劑量就能感染的食源性病原微生物,其具有致病性。大腸桿菌O157∶H7是腸出血性大腸桿菌的主要病原血清型,能夠引起人的出血性腹瀉和腸炎,且極易并發(fā)溶血性尿毒綜合癥和血栓性血小板減少性紫癜,嚴(yán)重時(shí)可致人死亡。大腸桿菌O157∶H7即使是低劑量污染新鮮農(nóng)產(chǎn)品,也可以使鮮切綠葉狀蔬菜對(duì)人類(lèi)造成嚴(yán)重的健康危害。Maribel等在25℃下對(duì)鮮切果蔬進(jìn)行貯藏,觀察大腸桿菌的變化,研究發(fā)現(xiàn)蔬菜在貯藏3d后,鮮切胡蘿卜中的大腸桿菌比鮮切萵苣中的多;而水果中,無(wú)論是在氣調(diào)包裝中還是空氣中貯藏1d后,鮮切西瓜中大腸桿菌的數(shù)量均增加,而鮮切菠蘿中大腸桿菌的數(shù)量沒(méi)有增加。在5℃下,大腸桿菌的數(shù)量沒(méi)有增加,但仍存活在鮮切果蔬中。研究人員發(fā)現(xiàn)將大腸桿菌O157∶H7接種到鮮切萵苣上,在8℃以上,大腸桿菌O157∶H7的數(shù)量會(huì)增加。RaybaudiMassilia等用肉桂和檸檬香草精油處理鮮切富士蘋(píng)果,能夠顯著降低貯藏期間大腸桿菌O157∶H7的數(shù)量。鮮切產(chǎn)品上大腸桿菌O157∶H7的生長(zhǎng)除了受內(nèi)在的以及外在的參數(shù)(如溫度、氣體成分等)的影響,加工的程度也會(huì)影響它的生長(zhǎng),比如切割的程度以及切割的方式。1.2鮮切蔬菜樣品的感染據(jù)美國(guó)疾病控制中心的統(tǒng)計(jì),沙門(mén)氏菌是世界范圍內(nèi)第二大食源性疾病致病菌,能夠引起腹瀉、高燒,嚴(yán)重情況下會(huì)提高人類(lèi)的發(fā)病率和死亡率。在西班牙坎皮納斯,從超市中隨機(jī)選取172例鮮切蔬菜樣品,其中有29例樣品被沙門(mén)氏菌所感染。到目前為止,已經(jīng)報(bào)道過(guò)4例芒果和2例木瓜暴發(fā)了沙門(mén)氏菌感染。沙門(mén)氏菌中最常見(jiàn)的就是鼠傷寒沙門(mén)氏菌。2008年,美國(guó)暴發(fā)的西紅柿沙門(mén)氏菌感染事件的罪魁禍?zhǔn)拙褪鞘髠抽T(mén)氏菌。研究人員發(fā)現(xiàn),在鮮切萵苣上接種鼠傷寒沙門(mén)氏菌,在4℃下沙門(mén)氏菌的數(shù)量會(huì)減少,在20℃下其數(shù)量會(huì)增加。鮮切卷心菜中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌在8℃下沒(méi)有增長(zhǎng),但在10℃下數(shù)量有所增加,這是一個(gè)影響貯藏條件的臨界值。1.3單增李菌的檢測(cè)結(jié)果據(jù)記載,第一例由食品引起的李斯特菌感染發(fā)生在1981年,發(fā)生在加拿大的一次沙拉制品的較大規(guī)模的污染事件,其中有41例被感染,7例致死。田靜等對(duì)蔬菜沙拉中的單增李斯特菌進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,發(fā)現(xiàn)在1581份樣品中,有1.52%被檢出有單增李斯特菌。單增李斯特菌是一種能引起人畜共患病的食源性致病菌,與其他食源性致病菌相比,單增李斯特菌感染相對(duì)比較少見(jiàn),但比常見(jiàn)的沙門(mén)氏菌和大腸桿菌更為致命。由于李斯特菌可以在低溫、低水分活度、低pH、高鹽的環(huán)境中持續(xù)生長(zhǎng)和繁殖,因此廣泛存在于自然界中,食品中存在的單增李斯特菌對(duì)人類(lèi)的安全具有威脅。研究發(fā)現(xiàn),鮮切蘋(píng)果上的單增李斯特菌在5℃下仍能夠生存。將鮮切萵苣和胡蘿卜放在4℃下的氣調(diào)包裝中進(jìn)行貯藏,發(fā)現(xiàn)李斯特菌不能夠生長(zhǎng)繁殖,但能夠存活。將鮮切萵苣放在氣體比例為10%O2+10%CO2的氣調(diào)包裝中,李斯特菌沒(méi)有顯著的增長(zhǎng)。1.4細(xì)菌致病毒血癥志賀氏桿菌是嗜溫的病原菌,當(dāng)鮮切果蔬的溫度高于10℃時(shí),它們大部分開(kāi)始生長(zhǎng)。志賀氏桿菌是人類(lèi)細(xì)菌性痢疾最為常見(jiàn)的病原菌,只需少量病菌進(jìn)入體內(nèi),就可致病,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致毒血癥。研究發(fā)現(xiàn),馬鈴薯沙拉中的志賀氏桿菌在2.5℃和8℃下數(shù)量并沒(méi)有減少。MaríaVictoriaSelma等用2ppm的臭氧水處理鮮切萵苣,發(fā)現(xiàn)其上的志賀氏菌數(shù)減少了0.9log單位。BarakatS.M.Mahmoud用1.0kGy的X-射線照射接種過(guò)志賀氏桿菌的切碎的卷心萵苣上,發(fā)現(xiàn)每5cm2切碎的卷心萵苣上,志賀氏桿菌減少4.4log單位。2化學(xué)保鮮中病原微生物的檢測(cè)1990年,美洲發(fā)現(xiàn)295例由于食用鮮切甜瓜引起的切斯特沙門(mén)氏菌感染。2000年,在威斯康星州有500多人由于食用鮮切果蔬而致病。由于鮮切果蔬易被病原微生物感染而導(dǎo)致疾病,因此檢測(cè)鮮切果蔬中的病原微生物是保障鮮切果蔬食用安全性的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)存在耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性低等缺點(diǎn)。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展,對(duì)鮮切果蔬中病原微生物的快速檢測(cè)方法也在不斷的更新和完善。目前,在鮮切果蔬中應(yīng)用的病原微生物快速檢測(cè)方法主要有以下幾種。2.1pcr檢測(cè)微生物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法是在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列,從而對(duì)病原微生物含量進(jìn)行快速檢測(cè)。在檢測(cè)時(shí),先將被檢微生物雙鏈DNA加熱變性為單鏈:而后在低溫情況下,人工合成的特異性引物與互補(bǔ)的單鏈DNA結(jié)合;在TaqDNA酶的最適溫度下,引物沿模板以5’→3’方向延伸,自動(dòng)合成新的DNA雙鏈。新合成的DNA雙鏈又可作為擴(kuò)增的模板,繼續(xù)重復(fù)以上的DNA多聚酶鏈反應(yīng),擴(kuò)增得到大量的被檢微生物DNA,最后一般在凝膠電泳下檢測(cè)目的DNA。PCR技術(shù)具有快速、精確、特異性高、成本低等優(yōu)點(diǎn),起初用于基因克隆和轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方面,現(xiàn)今已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域。直到近幾年,PCR技術(shù)才廣泛應(yīng)用到食品安全檢測(cè)中。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展,再加之與其他技術(shù)相結(jié)合,現(xiàn)衍生出許多優(yōu)良的PCR技術(shù),如實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR,RT-PCR)、熒光定量PCR、多重PCR等。Yun-JiKim等建立了大腸桿菌O157∶H7的RT-PCR檢測(cè)方法,其中檢測(cè)限達(dá)到1.53logCFU·mL-1,操作時(shí)間為2h。GSánchez等建立了大腸桿菌O157∶H7、李斯特菌、沙門(mén)氏菌的RT-PCR檢測(cè)方法,檢測(cè)限分別為103、102、103CFU/g,并且發(fā)現(xiàn)這種方法可同時(shí)檢測(cè)鮮切蔬菜上兩種類(lèi)型的食源性致病菌。PatriciaElizaquível等研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于檢測(cè)和定量鮮切蔬菜上的病原微生物,疊氮溴化丙錠(PMA)與PCR技術(shù)相結(jié)合的方法是可行的。目前,也已經(jīng)有報(bào)道針對(duì)大腸桿菌O157∶H7、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的多重PCR方法。2.2酶聯(lián)免疫法檢測(cè)鮮切果蔬中的病原菌微生物從20世紀(jì)80年代中后期開(kāi)始,就有人運(yùn)用該法進(jìn)行了有關(guān)食品中病原微生物快速檢測(cè)的研究。酶聯(lián)免疫法可檢測(cè)鮮切果蔬中常見(jiàn)的大腸桿菌O157∶H7、沙門(mén)氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌等病原微生物。酶聯(lián)免疫法具有檢測(cè)速度快、靈敏性高、特異性強(qiáng)、結(jié)果定量等優(yōu)點(diǎn)。Kang等曾采用ELISA間接法測(cè)定大腸桿菌O157∶H7。葛俊偉等建立了利用重組李氏桿菌溶血素(LLO)檢測(cè)單增李斯特菌的ELISA方法。2.3生物熒光素和atp的氧化機(jī)理ATP生物發(fā)光法主要是通過(guò)測(cè)定溶液中ATP的量來(lái)間接測(cè)定活菌總數(shù),從而能夠檢測(cè)樣品的衛(wèi)生狀況。其原理是利用細(xì)菌細(xì)胞裂解時(shí)釋放出的三磷酸腺苷(ATP),在有氧的情況下,螢火蟲(chóng)熒光素和ATP在螢火蟲(chóng)熒光素酶的催化下發(fā)生氧化反應(yīng)而形成氧化熒光素并發(fā)出熒光。在一個(gè)反應(yīng)中,當(dāng)螢火蟲(chóng)熒光素酶和螢火蟲(chóng)熒光素過(guò)量時(shí),ATP的量通過(guò)熒光的強(qiáng)度來(lái)表示,細(xì)菌中ATP的量與細(xì)菌數(shù)成正相關(guān),從而推斷出菌落總數(shù)。用ATP生物發(fā)光技術(shù)可以檢測(cè)鮮切果蔬細(xì)菌污染狀況能夠達(dá)到快速適時(shí)的目標(biāo)。ATP生物發(fā)光法曾用于檢測(cè)鮮切瓜中的微生物。ATP生物發(fā)光法檢測(cè)快速,每次檢測(cè)微生物ATP的時(shí)間可以控制在幾分鐘之內(nèi),操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,適合在鮮切果蔬安全檢測(cè)中進(jìn)行推廣應(yīng)用。2.4熒光定量技術(shù)熒光原位雜交(FISH)是一種通過(guò)特定分子的熒光標(biāo)記探針與染色體上特意的互補(bǔ)核酸序列原位雜交,通過(guò)激發(fā)雜交探針的熒光來(lái)檢測(cè)信號(hào),從而進(jìn)行定性和相對(duì)定量分析。該技術(shù)具有高度的敏感性、定位準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。YolandaMoreno等用DVC-FISH技術(shù)對(duì)191個(gè)蔬菜樣品(其中包括新鮮蔬菜、冷凍蔬菜、氣調(diào)包裝下的鮮切蔬菜)進(jìn)行單增李斯特菌的檢測(cè),檢測(cè)出32.98%的樣品中含有單增李斯特菌,此技術(shù)用于快速檢測(cè)單增李斯特菌是可行的。2.5電導(dǎo)性培養(yǎng)基檢測(cè)全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)是一種以電阻抗原理為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)和計(jì)數(shù)微生物的系統(tǒng)。在培養(yǎng)微生物的過(guò)程中將電惰性底物轉(zhuǎn)化為電活性產(chǎn)物,從而降低培養(yǎng)物的阻抗,微生物的數(shù)量可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基中的電導(dǎo)性變化來(lái)表示。檢測(cè)樣品中的菌落總數(shù)、乳酸菌、大腸菌群和霉菌等可以根據(jù)需要選擇不同的培養(yǎng)基來(lái)實(shí)現(xiàn),檢測(cè)菌落總數(shù)和大腸菌群可以在24h之內(nèi)完成,并且污染越嚴(yán)重,檢測(cè)越迅速,甚至幾個(gè)小時(shí)就能出結(jié)果。該系統(tǒng)能夠明顯節(jié)省時(shí)間、人力和物力,要優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法。法國(guó)生物梅里埃集團(tuán)生產(chǎn)的VIDAS全自動(dòng)快速致病菌篩選系統(tǒng)能檢測(cè)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等常見(jiàn)的致病菌。2010年,我國(guó)廣東省對(duì)沙拉中食源性致病微生物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)所采取的是熒光定量PCR方法與mini-VIDAS全自動(dòng)熒光檢測(cè)相結(jié)合的方法。3不同快速檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用的檢測(cè)結(jié)果鮮切果蔬是一種能夠保持水果、蔬菜原有風(fēng)味和品質(zhì)的生鮮食品,具有呼吸代謝等生命活動(dòng),在加工、貯藏過(guò)程中極易被食源性病原微生物感染而給消費(fèi)者帶來(lái)危害。鮮切果蔬中的病原微生物污染與消費(fèi)者的健康息息相關(guān),因此,在鮮切果蔬上市