吉林大學(xué) 發(fā)光免疫分析法

發(fā)光免疫分析法

LuminescenceImmunoassay/一．概論

免疫性是動物在長期進化過程中逐漸發(fā)展起來的防御感染和維護機體完整性的十分有效而靈巧的手段。免疫系統(tǒng)的特殊功能是識別“自我”和“非自我”的物質(zhì)，對自身的物質(zhì)不起反應(yīng)，而對外源的及體內(nèi)改變了的物質(zhì)則能起專一的免疫反應(yīng)，排除其對機體的危害。另一方面，免疫系統(tǒng)還擔(dān)負著維持機體免疫狀態(tài)的自身穩(wěn)定性，以清除體內(nèi)衰老和突變的細胞。

1．抗體和抗原（Antigen,Antibody）免疫學(xué)的重要對象是抗原和抗體的反應(yīng)問題。抗原是一種外來物質(zhì)，當其進入動物體內(nèi)能引起抗體的產(chǎn)生，并能和抗體反應(yīng)的物質(zhì)?？贵w(antibody.Ab)與抗原(antigen.Ag)的結(jié)合具有極高的專一性和親合性。不能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，但能和適當抗體起反應(yīng)，即有免疫反應(yīng)性的簡單分子稱為半抗原。

（1）抗原蛋白質(zhì)，多糖，核酸，合成多肽，低分子物質(zhì)（2）抗體抗體是一種蛋白質(zhì)（主要是γ-球蛋白質(zhì)）血清蛋白質(zhì)在自由電泳場中白蛋白α-球蛋白β-球蛋白γ-球蛋白抗體存在于β-球蛋白和γ-球蛋白內(nèi)這些蛋白質(zhì)稱為免疫球蛋白IgM.IgA.IgG.IgD和IgEγM.γA.γG.γD.γE2.放射性免疫分析（RIA）1959Berson和Yallow將免疫反應(yīng)與分析化學(xué)相結(jié)合創(chuàng)立了放射性免疫分析法。荷爾蒙的測定先將荷爾蒙注入天竺鼠體內(nèi)對抗此抗原的抗體（Ab）Ag*+Ab===Ag*-Ab要測定一病人的血清標本中荷爾蒙的濃度，Ag+Ag*-Ab===Ag-Ab+Ag*(+Ag*-Ab)測定Ag*，可計算標本中所含有的荷爾蒙（Ag）濃度1977獲諾貝爾醫(yī)學(xué)生物學(xué)獎分析對象：測量含量很低的生物活性化合物：如蛋白質(zhì)（酶，接受體，抗體）激素（甾族化合物，甲狀腺激素，酞激素）藥物及微生物等。優(yōu)點：專一性強，靈敏度高缺點：①放射性同位素可能損害人們的身體健康，以致于實驗室要有特殊防護技術(shù)②該法還需要用貴重的閃爍計數(shù)器和試劑③穩(wěn)定性-同位素的壽命相對較短

3酶免疫分析法用酶標記抗原或抗體

例：酶聯(lián)免疫法測定氯霉素微量反應(yīng)板——羊抗兔IgG抗體兔抗氯霉素抗體+氯霉素酶結(jié)合物

+氯霉素樣品沒有結(jié)合的酶結(jié)合物被洗去，再向相應(yīng)孔中加入過氧化氫和鄰苯二胺，作用一定時間后，結(jié)合后的酶結(jié)合物將無色的鄰苯二胺轉(zhuǎn)化為藍色的產(chǎn)物，加入終止液后顏色由藍變黃，用波長450nm（雙波長時最適參考波長≥600nm）酶標儀進行檢測，吸光值與樣品中氯霉素含量成反比。酶不穩(wěn)定、光度分析線性范圍窄

競爭型酶聯(lián)免疫法測定氯霉素含量示意圖4.發(fā)光免疫分析法熒光免疫分析法化學(xué)發(fā)光免疫分析法以熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)物質(zhì)作為標記物。優(yōu)點：專一性強靈敏度高穩(wěn)定性好，可避免放射性污染標記物不同，因而檢測方法也不同二．熒光免疫分析法FluonescenseImmuuoassay1．熒光探針（1）

一般要求a檢測最常遇到的樣品為血清，它有很高的熒光背景。

血清蛋白λem325-350nm(λex280nm)

血清中NADH和膽紅素430-470nm(λex330-360nm)

探針λem>500nmb.熒光探針的斯托克斯位移〉50nmc.熒光探針的摩爾吸光系數(shù)要大熒光產(chǎn)率應(yīng)盡可能高

d.熒光探針要穩(wěn)定，且聯(lián)結(jié)于抗體或抗原時不應(yīng)損害它們的活性

e.熒光探針的激發(fā)波長應(yīng)位于可見光區(qū)，因為較長波長處熒光雜質(zhì)較少

λex

應(yīng)位于vis區(qū)

(2)有機探針

熒光黃常用的探針熒光產(chǎn)率高，有較好的光穩(wěn)定性和低的溫度系數(shù)。其缺點是斯托克斯位移較小。在堿性的條件下，熒光黃與免疫球蛋白IgG的自由氨基起反應(yīng).

羅丹明類化合物廣泛用來標記抗體和熒光黃相比，其熒光產(chǎn)率不如熒光黃，可是其發(fā)射波長較長，樣品背景干擾較少。此外，羅丹明類亦常作為能量轉(zhuǎn)移的接受體。(3)

金屬螯合物某些稀土金屬離子會與某些配位體生成會發(fā)強熒光的配合物。如：Eu(Ⅲ),Tb(Ⅲ),Nd(Ⅲ)與

β-二酮衍生物對-氨基甲酰三氟丙酮聚氨羧酯鹽鄰菲羅啉

稀土金屬離子配合物lifetime50~1000s

熒光背景103~106倍

2．熒光免疫檢測法的類型（1）均質(zhì)檢測法均質(zhì)檢測法不需要分離步驟，方法簡便快速，但它常受到來自背景（血清）的干擾，該法系根據(jù)已標記抗原聯(lián)接于抗體時發(fā)生已標記抗原熒光性質(zhì)的改變。通常將均質(zhì)檢驗法分為：

熒光增強法熒光猝滅法間接猝滅法熒光激發(fā)轉(zhuǎn)移水解法熒光偏振法a．熒光增強法本法基于當標記物的抗原聯(lián)接于抗體時原標記的抗原熒光強度增強。b．熒光猝滅法當被標記的抗原聯(lián)接到抗體時熒光的量子產(chǎn)率下降，例如慶大霉素的測定，將限量的抗體加入一已被標記和未標記的慶大霉素混合物中，熒光猝滅程度與慶大霉素量相關(guān)。c.間接猝滅法

d.熒光激發(fā)轉(zhuǎn)移如熒光黃作為給予體，羅丹明作為接受體，熒光黃的熒光與羅丹明的吸收光譜重疊，后者可吸收前者的熒光。例：嗎啡的測定

i)用熒光黃（F）標記抗原羅丹明（R）標記抗體

Ag+AgF+AbR(Ag-AbR)+(AgF-AbR)Ag的存在減少了熒光的猝滅程度

ii)抗體既是給予體又是接受體

Ag+AbF+AbRAbF-Ag-AbRe.水解法2）非均質(zhì)檢測法非均質(zhì)檢測法在檢測之前，必須進行分離。既游離的已標記的抗原必須從聯(lián)接于抗體的抗原中分離出來，或者未聯(lián)接的已標記的抗體從抗原聯(lián)接的部分分離出來。其分離可通過離心沉降，或固相聯(lián)接抗原（或抗體）來實現(xiàn)。固相型檢測法包括競爭性和非競爭性反應(yīng)的標記抗原或抗體

抗原聯(lián)接于聚合物表面-----免疫吸附劑

時間分辨熒光法消除樣品背景干擾的另一種方法是時間分辨熒光法。樣品背景的熒光壽命一般為10ns，而鑭系鰲合物的熒光壽命一般為10-100μs。且斯托克斯位移較大，很適用于時間分辨法進行測定。時間分辨熒光免疫原理圖

（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）熒光免疫分析法優(yōu)點：

消除放射性同位素的污染

穩(wěn)定性較好缺點：高的背景光，限制了靈敏度干擾測定三．化學(xué)發(fā)光免疫分析法這種分析方法既有發(fā)光檢測的高靈敏度，又有免疫分析法的特異性。

1．主要發(fā)光體系

魯米諾，異魯米諾及其衍生物焦焙酚光澤精吖啶酯

1，2-雙氧基化合物過氧化草酸酯

螢火蟲發(fā)光體系細菌發(fā)光體系

2.發(fā)光標記物（1）發(fā)光反應(yīng)中消耗掉的標記物

a．Luminol及其衍生物

Luminol偶聯(lián)于配體后，其發(fā)光效率較低

Isoluminol及其衍生物被廣泛應(yīng)用

Luminol的氨基取代導(dǎo)致Ф降低

Isoluminol的氨基取代導(dǎo)致Ф增加

此類標記可用于各種分析物，但CL需催化劑，因此有較高的背景信號。b．吖啶酯類不需要催化劑

優(yōu)點：高量子產(chǎn)率，低背景信號和易于與蛋白質(zhì)連接，主要用于標記半抗原和蛋白質(zhì)。缺點：光發(fā)射是瞬時的c．過氧化草酸酯優(yōu)點：靈活性缺點：過氧化草酸酯水溶性較差，極易水解。二氧雜四元環(huán)酮延長的光發(fā)射、低背景、寬的線性范圍（2）不起發(fā)光反應(yīng)的標記物這類標記物在發(fā)光過程中不被消耗，反應(yīng)過程中起催化作用的物質(zhì)。a．過氧化物酶（peroxidase,POD）

Luminol+H2O2

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用POD標記分析物b．蟲熒光素酶，細菌熒光素酶酶成本昂貴，不穩(wěn)定，熒光酶基因的制造c．熒光物質(zhì)作為標記物熒光素，丹璜酰氯，熒光胺，羅丹明（3）酶標記物GOD和G-6-PDH

利用某些酶作為標記物，然后通過標記的酶催化生成的產(chǎn)物，再作用于發(fā)光物質(zhì)，以產(chǎn)生生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光。葡萄糖

（4）固相法發(fā)光免疫分析它不需要離心處理，操作簡便，精確度高，所用固相支持物主要有聚苯乙烯制的管和球競爭法：（檢查小分子抗原多采用）啟動發(fā)光試劑Ag+Ag-L+Ab

Ag-Ab+Ab-Ag-L—————

h

夾心法：（檢查大分子抗原多采用）

Sp-Ab+Ag

Sp-Ab-AgSp-Ab-Ag+Ab-L

Sp-Ab-Ag-Ab—啟動發(fā)光試劑———