發(fā)酵工程10現(xiàn)代生物技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用09-10new

發(fā)酵工程李賽男1第十章現(xiàn)代生物技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用生物技術(shù)（biotechnology），又稱生物工程或生物工藝學(xué)。其內(nèi)容大致可分為以下兩個(gè)方面：直接型生物細(xì)胞的利用技術(shù)和模擬型生物細(xì)胞的利用技術(shù)。以現(xiàn)代前沿技術(shù)來(lái)說(shuō)，一般認(rèn)為生物技術(shù)有四個(gè)方面：基因操作技術(shù)；細(xì)胞融合技術(shù)；細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)和生物反應(yīng)器技術(shù)。也可概括為：基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶工程和生化工程。2一、工程菌的發(fā)酵一）工程菌的來(lái)源通過基因工程所得的重組體菌株即是工程菌。

基因工程的關(guān)鍵問題：目的基因在宿主細(xì)胞中能否表達(dá)，即外源DNA在宿主細(xì)胞中能否轉(zhuǎn)錄和翻譯，表達(dá)形成的產(chǎn)物在胞內(nèi)不被分解，并能分泌到胞外。

3

二）工程菌的培養(yǎng)（一）基因重組細(xì)胞的種類宿主細(xì)胞可以采用原核的大腸桿菌和枯草桿菌、真核細(xì)胞的酵母菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。（二）工程菌的培養(yǎng)從培養(yǎng)過程來(lái)看，其主要因素有：營(yíng)養(yǎng)源（碳源、氮源、氨基酸、溶解氧等）濃度的控制和有毒代謝產(chǎn)物的排除。在生物學(xué)上還應(yīng)考慮：質(zhì)粒的穩(wěn)定性、質(zhì)?？截悢?shù)的控制、轉(zhuǎn)錄效率的提高與控制、翻譯效率的提高以及菌體向外分泌產(chǎn)物等因素。41、培養(yǎng)裝置工程菌的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)仍使用常規(guī)的培養(yǎng)皿、試管、玻璃瓶等培養(yǎng)器。以大腸桿菌為宿主的培養(yǎng)多使用一般的通氣攪拌罐。工程菌的培養(yǎng)裝置與沿用的通氣攪拌式培養(yǎng)罐的區(qū)別：工程菌的培養(yǎng)裝置既要防止外界微生物侵入罐內(nèi)污染雜菌，又必須不使重組體外漏。52、培養(yǎng)基和高密度發(fā)酵

工程菌發(fā)酵有兩條基本要求：首先是要使菌體生長(zhǎng)良好，獲得高濃度菌體（即高密度發(fā)酵），這樣才能得到最多的產(chǎn)物；其次是發(fā)酵所用培養(yǎng)基的成分必須保持盡可能的簡(jiǎn)單，以便分離產(chǎn)物。從安全性來(lái)考慮菌體營(yíng)養(yǎng)源的問題，培養(yǎng)工程菌的外界條件至少要遵守物理密封（P1~P4）方法中的P1級(jí)規(guī)定。從生物安全性來(lái)考慮，常采用維生素或氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的工程菌。3、菌株和質(zhì)粒的穩(wěn)定性在工業(yè)發(fā)酵運(yùn)行中，菌株必須具有很好的穩(wěn)定性。對(duì)工程菌發(fā)酵來(lái)說(shuō)，細(xì)胞中的質(zhì)粒的穩(wěn)定性和質(zhì)粒內(nèi)在的穩(wěn)定性同樣也是很重要的。6三）安全問題（一）重組DNA實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則1974年，提出了DNA重組實(shí)驗(yàn)具有潛在生物危險(xiǎn)性的問題。后來(lái)制訂了在實(shí)驗(yàn)室中構(gòu)建工程菌及使用工程菌的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)遵循的準(zhǔn)則，這些準(zhǔn)則是采用物理密封（P1~P4）和生物學(xué)密封（B1和B2）兩種方法。

物理密封是將重組菌密封于設(shè)備內(nèi)，以防傳染給實(shí)驗(yàn)人員和向外界擴(kuò)散。實(shí)驗(yàn)規(guī)模在20L以下時(shí)，物理密封由密封設(shè)施、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)所組成。密封程度分為P1、P2、P3和P4級(jí)，數(shù)字越大，密封水平越高。

7生物學(xué)密封要求只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時(shí)用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴(kuò)散。按密封程度分為B1和B2級(jí)。8（二）防止基因重組菌外漏的措施在普通通氣攪拌培養(yǎng)罐培養(yǎng)菌體時(shí)，可能發(fā)生外漏的部分和操作有：1）排氣；2）機(jī)械密封；3）取樣；4）培養(yǎng)后的滅菌；5）接種；6）放罐。這些部分和操作均應(yīng)采取措施，以防重組體外漏。9二、動(dòng)植物細(xì)胞的組織培養(yǎng)一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指在體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)，即在無(wú)菌條件下，從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，或利用已經(jīng)建立的動(dòng)物細(xì)胞系，模擬機(jī)體內(nèi)的正常生理狀態(tài)下生存的基本條件，讓細(xì)胞在培養(yǎng)容器中生存、生長(zhǎng)和繁殖的方法。

10動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的總體差異內(nèi)容微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞壁普遍存在不存在生長(zhǎng)速率0.1~0.5h-10.01~0.05h-1需氧量高低營(yíng)養(yǎng)要求普遍簡(jiǎn)單復(fù)雜CO2需求一些微生物需CO2許多需要CO2形成緩沖液環(huán)境影響小大大小范圍100~2000nm10000~100000nm接種濃度低高（10-5.ml-1）生長(zhǎng)濃度高（109~1010.ml-1）低（106.ml-1）11

1、細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素

2、細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差

3、需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌

4、群體生長(zhǎng)效應(yīng)，貼壁生長(zhǎng)（錨地依賴性）

5、培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高

6、原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡

（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性12（二）細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成（1）水通常細(xì)胞培養(yǎng)用水的污染物標(biāo)準(zhǔn)可參考醫(yī)藥上注射用水標(biāo)準(zhǔn)，但原則上應(yīng)高于注射用水標(biāo)準(zhǔn)。（2）低相對(duì)分子質(zhì)量營(yíng)養(yǎng)物(A)能源和碳源物質(zhì)主要是糖及糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺。(B)氮源(氨基酸)(C)維生素(D)無(wú)機(jī)離子(E)脂類和磷脂前體(F)核酸前體13（3）非營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)(A)抗生素細(xì)胞培養(yǎng)中，常使用抗生素抑制微生物的污染。(B)pH緩沖劑最常用的pH緩沖劑是碳酸氫鈉,常用濃度26mmol/L。(C)酚紅酚紅普遍作為培養(yǎng)基的pH指示劑。(D)保護(hù)劑細(xì)胞保護(hù)劑指保護(hù)細(xì)胞免受由滲透壓變化、剪切、毒性金屬和氧化所引起的損傷的物質(zhì)。(E)還原劑某些還原劑在細(xì)胞培養(yǎng)中有特殊作用。β巰基乙醇在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中能刺激抗體分泌，并促進(jìn)半胱氨酸利用。14（4）血清在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，常用的血清是小牛血清、胎牛血清、馬血清和人血清。最常用的是小牛血清，胎牛血清次之，用于要求更高的細(xì)胞系。人血清用于一些人細(xì)胞系。血清是極復(fù)雜的混合物，含有食物物質(zhì)、代謝物、激素、血漿蛋白、破碎細(xì)胞釋放物質(zhì)(如血紅蛋白和血小板的生長(zhǎng)因子)、采血中引入的污染物。15（三）動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)由于細(xì)胞類型不同，故有下列幾種培養(yǎng)技術(shù)：1）懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)指細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長(zhǎng)的過程，主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。162）貼壁附著培養(yǎng)為了增大附著面積，過去常用扁瓶和轉(zhuǎn)瓶簡(jiǎn)單裝置來(lái)進(jìn)行單層靜置培養(yǎng)。現(xiàn)已開發(fā)出各種形式的培養(yǎng)裝置，如旋轉(zhuǎn)瓶和多段式托盤培養(yǎng)裝置等，已用于β-干擾素的生產(chǎn)。3）微載體培養(yǎng)微載體是指直徑在60－250nm、適合于動(dòng)物細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)的微珠。17（四）生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)模式無(wú)論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，就操作方式而言，深層培養(yǎng)可分為：1）分批培養(yǎng)2）流加培養(yǎng)3）半連續(xù)培養(yǎng)4）連續(xù)培養(yǎng)5）灌注培養(yǎng)灌注培養(yǎng)是指細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)器，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。18二）植物