銀杏多糖的提取及乙酰化法取代度的測定

銀杏多糖的提取及乙?；ㄈ〈鹊臏y定

根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)實驗，白銀的生物活性主要與白銀糖有關(guān)。真菌多糖生物活性的發(fā)揮與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān),對多糖進行結(jié)構(gòu)修飾可能會使其具有一些新的理化性質(zhì)或生物活性,可作為研究多糖構(gòu)效關(guān)系的有效方法,是目前多糖研究領(lǐng)域的熱點之一。多糖結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾主要是利用多糖分子中的羥基、羧基、氨基等活性基團進行化學(xué)反應(yīng)以引入新的基團,如硫酸基、磷酸基、羧甲基、烷基等。乙酰化多糖的乙?；芨淖兌嗵欠肿拥亩ㄏ蛐院蜋M次序,從而改變多糖的物理性質(zhì),乙酰基的引入使分子的伸展?fàn)顟B(tài)發(fā)生變化,導(dǎo)致多糖極性基團暴露,增加在水中的溶解性,同時乙?；臄?shù)量和位置對多糖活性也有顯著影響。銀耳多糖乙?；揎椷€未見文獻報道,因此本文以乙酸酐作為?；噭︺y耳多糖進行化學(xué)修飾,研究建立了羥胺比色法測定乙?；y耳多糖取代度的方法,其研究結(jié)果將會為銀耳多糖進行構(gòu)效關(guān)系探討打下良好基礎(chǔ)。1材料和方法1.1試劑與儀器銀耳干品市售;苯酚、氫氧化鈉、濃鹽酸、鹽酸羥胺、六水三氯化鐵、醋酸鈉、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、乙酸酐、無水乙醇國產(chǎn)分析純試劑;葡萄糖、氯化乙酰膽堿國產(chǎn)標準品;透析袋MW8000,美國聯(lián)合碳化。GL-21M型高速冷凍離心機湘儀;UV-1800型紫外分光光度計、UV-2802PC型紫外掃描儀尤尼柯;FD-1C-55型真空冷凍干機北京博醫(yī)康;FA2004B型電子天平上海天美;FZ102型微型植物試樣粉碎機北京中興偉業(yè)。1.2實驗方法1.2.1水浸提取液制備銀耳子實體70~80℃干燥2h,粉碎并過60目篩。室溫條件下用乙醇(80%)攪拌浸泡銀耳粉末12h,減壓抽濾,濾餅用10倍體積70℃的水浸提5h,10000r/min冷凍離心10min,取上清液,并重復(fù)浸提1次。合并提取液,減壓濃縮,向殘余物中加入乙醇至終濃度80%,攪拌過夜,離心,收集沉淀,依次用無水乙醇、丙酮、乙醚依次充分洗滌,真空冷凍干燥,制得銀耳粗多糖。1.2.2銀耳多糖的檢測采用Sevage法除去銀耳多糖中的蛋白類雜質(zhì),向多糖水溶液中加入適量的Sevage試劑(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1),劇烈振蕩30min,10000r/min冷凍離心10min,去除沉淀,取上清液,重復(fù)上述操作,紫外掃描檢測,直至銀耳多糖溶液在260nm和280nm處無明顯吸收,表示其中的蛋白類雜質(zhì)已除盡。1.2.3標準曲線的制作葡萄糖標準品在105℃條件下干燥至恒重,精確稱取0.2000g,蒸餾水溶解并定容至100mL,溶液濃度為2mg/mL,分別量取葡萄糖標準溶液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL置于50mL容量瓶中,并定容至刻度配制標準溶液,濃度分別為0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20mg/mL。將50mL濃硫酸緩緩加入10mL水中冷卻至室溫,加入0.6g苯酚晶體攪拌使其溶解配成顯色液。取1.00mL葡萄糖標準溶液或待測試樣溶液置于試管中,加入5.00mL顯色液,振蕩混勻。置于沸水浴中保溫30min,取出,放在冷水浴中,冷卻至室溫,于490nm處測定其吸光度值。1.2.4控制反應(yīng)ph取0.50g銀耳多糖溶解于10mL水中,用3%氫氧化鈉調(diào)pH至11.0。室溫條件下交替加入氫氧化鈉溶液和乙酸酐,使反應(yīng)溶液的pH控制在7.0~11.0范圍內(nèi),直至3.0mL乙酸酐加完,25~30℃下反應(yīng)液維持pH為8.0攪拌反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后,用1.0mol/L鹽酸中和反應(yīng)溶液至pH=7.0,將反應(yīng)液置于透析袋中,第1、2d自來水透析,第3d蒸餾水透析,3d后取出將內(nèi)液減壓蒸餾至小體積,加入少量蒸餾水溶解后進行真空冷凍干燥,研磨,得到乙酰化銀耳多糖。1.2.5乙酰基取代度的測定1.2.5.藥品及其他總氮酸鈉標準品溶液A:鹽酸羥胺溶液(2mol/L)取鹽酸羥胺13.9g,加水定容至100mL,冷藏保存;B:氫氧化鈉溶液(3.5mol/L):稱取氫氧化鈉14.0g,加水定容至100mL;C:鹽酸溶液(4.0mol/L):取濃鹽酸33.3mL,加水定容至100mL;D:三氯化鐵-鹽酸溶液(0.37mol/L):稱取FeCl3·6H2O10.0g,加0.1mol/L鹽酸溶液定容至100mL;E:堿性羥胺溶液:將等體積的鹽酸羥胺溶液與氫氧化鈉混合配制,現(xiàn)配現(xiàn)用;F:醋酸鈉溶液(0.001mol/L):稱取醋酸鈉0.0205g配制成250mL溶液;G:氯化乙酰膽堿標準溶液:精確稱取氯化乙酰膽堿標準品53.2mg,置于50mL容量瓶中,加0.001mol/L醋酸鈉溶液溶解,定容,現(xiàn)配現(xiàn)用;H:樣品溶液(0.218mg/mL):稱取乙?；y耳多糖54.5mg,置于50mL容量瓶中,加0.001mol/L醋酸鈉溶液溶解,定容。1.2.5.2.標準曲線的制備1.2.5.乙?；y耳多糖的取代度根據(jù)標準曲線得到乙?；y耳多糖的乙酰基含量M1,按公式(1)先計算出乙?；y耳多糖中乙?；陌俜趾縒,再根據(jù)公式(2)計算乙?；y耳多糖的取代度。式中,M1-乙?；y耳多糖中乙?；馁|(zhì)量(mg);M2-乙?；y耳多糖的質(zhì)量(mg);162-多糖每個糖單元相對分子質(zhì)量;43-乙?；鄬Ψ肿淤|(zhì)量;1-氫原子的相對原子質(zhì)量。2結(jié)果與分析2.1銀耳多糖的純化銀耳多糖經(jīng)Sevage試劑重復(fù)操作8次后的紫外掃描圖譜見圖1,在260nm和280nm處無明顯吸收,表明純化得到的銀耳多糖中已基本除去蛋白類雜質(zhì)。然后經(jīng)80%乙醇析出沉淀,真空冷凍干燥得銀耳多糖,提取率為9.1%。2.2sevage試劑純化的銀耳多糖的制備硫酸苯酚法測定銀耳多糖含量的標準曲線見圖2,回歸方程為y=1.3821x+0.0168,R2=0.9965,在葡萄糖濃度0.08~0.2mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,測得經(jīng)Sevage試劑純化的銀耳多糖含量為80.03%。2.3y.0.4.4.3氯化乙酰膽堿標準品乙酰基濃度與其吸光度標準曲線見圖3,回歸方程為y=0.0118x+0.0036,R2=0.9991。在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,根據(jù)回歸方程計算得乙酰化銀耳多糖乙?；鶟舛葹?1.75μg/mL,計算其取代度為0.214。3乙?；y耳多糖結(jié)構(gòu)解析及活性研究以水提醇沉法制備的銀耳多糖經(jīng)Sevage試劑處理8次得到較好的純化效果,硫酸苯酚法測定其含量為80.03%,雖然該法對銀耳多糖純化效率較低但仍然是目前去除蛋白類雜質(zhì)的常用方法,銀耳多糖的提取率為9.1%。多糖在酸催化下進行酯化反應(yīng)往往會伴隨著多糖鏈的降解,為了抑制多糖鏈的降解過程可以選擇在堿性條件下完成酯化反應(yīng);因此本文選擇在氫氧化鈉水溶液的均相體系中以乙酸酐為?；噭︺y耳多糖進行乙?；揎?為了避免生成的酯在堿性條件下水解需要及時調(diào)整反應(yīng)液的pH,在本實驗條件下獲得了低取代度的乙?；y耳多糖(DS=0.214)。乙?；嗵巧锘钚圆粌H受到乙?；鶖?shù)量的影響,還與取代的位置相關(guān),O-3位具有乙酰基時,多糖抗腫瘤活性最強;O-5位具有乙?；鶗r,抗腫瘤活性顯著減弱;當(dāng)O位全部乙?；瘯r,活性消失。因此對乙?；y耳多糖進行結(jié)構(gòu)解析以及相應(yīng)的生物活性研究將成為我們后續(xù)研究的方向。精確移取氯化乙酰膽堿標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分別置于試管中,加水補足至1mL,加2mL新鮮配制的堿性羥胺溶液,搖勻,于室溫中放置4min,加1mL4mol/L鹽酸,使得pH=1.2±0.