生物化學教學課件：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis一.實驗?zāi)康?/p>

1.學習SDS測定蛋白質(zhì)分子量的原理

2.掌握垂直板電泳的操作方法

二.實驗原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳:是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基硫酸鈉）1967年，Shapiro等人首先發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺凝膠中主要取決于三種因素：蛋白大小，形狀和電荷)系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量大??？SDS的作用SDSisastrongdetergentagentusedtodenaturenativeproteinstounfolded,individualpolypeptides.Whenaproteinmixtureisheatedto100°CinpresenceofSDS,thedetergentwrapsaroundthepolypeptidebackbone.Itbindstopolypeptidesinaconstantweightratioof1.4gSDS/gofpolypeptide.Inthisprocess,theintrinsicchargesofpolypeptidesbecomesnegligiblewhencomparedtothenegativechargescontributedbySDS.Thuspolypeptidesaftertreatmentbecomerod-likestructurespossessingauniformchargedensity,thatissamenetnegativechargeperunitlength.Theelectrophoreticmobilitiesoftheseproteinswillbealinearfunctionofthelogarithmsoftheirmolecularweights.

當?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15,000－200,000之間時，樣品的遷移率與其分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。符合如下方程式：lgMW=－b

m+K

其中，MW為蛋白質(zhì)的分子量，m相對遷移率，b為斜率，K為截距。當條件一定時，b與K均為常數(shù)因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較，就可以得出未知蛋白的分子量SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200Ammonium(AP)

(N2H8S2O8;MW:228.2).APSisasourceoffreeradicalsandisoftenusedasaninitiatorforgelformation.TEMED(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine)(C6H16N2;MW:116.21).TEMEDstabilizesfreeradicalsandimprovespolymerization

垂直板電泳裝置加樣樣品遷移方向電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒?；旌蠘悠穾Э啄z

按分子大小分離電泳方向

電泳

小分子大分子夾在兩塊玻璃板之間的凝膠

電泳緩沖液

電泳緩沖液

加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品分子量小分子量大電源電泳后的凝膠徑考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片標準蛋白分子量未知蛋白在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過標準曲線求未知多肽鏈分子量。

相對遷移率水平式電泳裝置電泳緩沖液凝膠操作過程1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干

2.把玻璃板在灌膠支架上固定好(放好密封條和隔離板)

*固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板

分離膠(12%)濃縮膠(5%)ddH2O4.3ml2.37ml40%Acr3.0ml0.5mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl2.5ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl1.0ml10%SDS0.1ml40μl10%Ap0.1ml40μlTEMED4μl4μl

配膠3.按比例配好分離膠,用移液槍快速加入（或直接用小燒杯倒入）,大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水（或異丙醇除泡）,靜置至膠凝

*凝膠配制過程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無法注膠。注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡*水封的目的：保持分離膠上沿平直，排氣泡,加速聚合.

*膠凝好的標志：膠與水層之間形成清晰的界面

4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至邊緣處,迅速插入梳子,靜置到膠凝

*梳子需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平

5.拔出樣梳后,拆掉密封條，在內(nèi)槽中加入緩沖液*用吸瓶將加樣孔內(nèi)和玻璃板下面放密封條位置的氣泡全部排出6.上樣：（1）marker10μl

（2）樣品（100℃沸水浴，3-5min處理并離心，蛋白變性）

7.微量注射器（加樣器）上樣,上樣量10-15μl

*微量注射器不可過低,以防刺破膠體；也不可過高,樣品下沉時易發(fā)生擴散，溢出加樣孔8.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，溴酚藍距凝膠邊緣約數(shù)cm時，停止電泳

9.凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入考馬斯亮藍染色染色液，染色20-30min左右

10.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰

*剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分

11.實驗結(jié)果分析注意的問題

蛋白質(zhì)電泳常用的SDS：單一亞基組成的蛋白質(zhì)非變性PAGE：多個不同亞基組成的蛋白質(zhì)

聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套試劑1.40%丙烯酰胺（Acr）：2.10%SDS（十二烷基硫酸鈉）3.1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.8，最后用蒸餾水定容至100ml4.0.5mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8，最后用蒸餾水定容至100ml

（7）10%過硫酸銨(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）樣品溶解液：

SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+溴酚藍（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）染色液：稱取考馬斯亮藍R2500.125g