蛋白質(zhì)分析技術(shù)課件

蛋白質(zhì)分析技術(shù)免疫研究室白莎莎baishasha@蛋白質(zhì)分析技術(shù)免疫研究室白莎莎1主要內(nèi)容理化性質(zhì)蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)濃度測定蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)免疫沉淀其他主要內(nèi)容理化性質(zhì)2氨基酸——多肽鏈——蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)分子量等電點(diǎn)活性理化性質(zhì)氨基酸——多肽鏈——蛋白質(zhì)理化性質(zhì)3蛋白質(zhì)分離純化組織破碎抽提粗提（粗分離）精制（細(xì)分離）結(jié)晶或蛋白質(zhì)干粉蛋白質(zhì)分離純化組織破碎抽提粗提（粗分離）精制（細(xì)分離）結(jié)晶或4蛋白質(zhì)的分離純化溶解度分子量所帶電荷特殊親和性蛋白質(zhì)的分離純化溶解度5蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度影響因素pH值離子強(qiáng)度介電常數(shù)溫度同一條件下,不同的蛋白質(zhì)因分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度。根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),適當(dāng)?shù)馗淖兺獠織l件,就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度,達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度影響因素同一條件下,不同的蛋白質(zhì)因6蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度常用方法等電點(diǎn)沉淀pH值調(diào)節(jié)鹽溶和鹽析有機(jī)溶劑提取法萃取法蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度常用方法等電點(diǎn)沉淀pH值調(diào)節(jié)鹽溶和7蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度等電點(diǎn)沉淀不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同,而蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低。pH值調(diào)節(jié)有些蛋白質(zhì)在特定pH值時(shí)溶解較高，因而可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值來分離純化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度等電點(diǎn)沉淀不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同,8蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度鹽溶和鹽析中性鹽可顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度。增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶,反之為鹽析。對比一價(jià)離子中性鹽如NaCl、NH4Cl，同樣濃度的二價(jià)離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質(zhì)溶解度影響更明顯。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。利用鹽溶和鹽析對蛋白質(zhì)進(jìn)行提純后,通常要使用透析或凝膠過濾的方法除去中性鹽。蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度鹽溶和鹽析中性鹽可顯著影響球狀蛋白9蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度有機(jī)溶劑提取法與水互溶的有機(jī)溶劑能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。室溫下,有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)沉淀的同時(shí)伴隨著變性。將有機(jī)溶劑冷卻,加入時(shí)不斷攪拌防止局部濃度過高。對于和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中極性側(cè)鏈較多、不溶于水的蛋白質(zhì),可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑提取,它們有一定的親水性和較強(qiáng)的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法最初用于免疫球蛋白的提取，是目前WHO規(guī)程和中國生物制品規(guī)程推薦的方法。分辨率高、提純效果好。蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度有機(jī)溶劑提取法與水互溶的有機(jī)溶劑能10蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度雙水相萃取技術(shù)ATPE（Aqueoustwophaseextraction）,是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,被分離物在兩相中分配不同便可實(shí)現(xiàn)分離。此方法可以在室溫環(huán)境下進(jìn)行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,收率較高。對于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì),需要先對細(xì)胞進(jìn)行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到濃縮,細(xì)胞碎片等固體物分布在下相中。采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強(qiáng)度、鹽類型及濃度的影響。反膠團(tuán)萃取法利用反膠團(tuán)將蛋白質(zhì)包裹其中而達(dá)到提取蛋白質(zhì)的目的。反膠團(tuán)是當(dāng)表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑溶解時(shí)自發(fā)聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。優(yōu)點(diǎn)是萃取過程中蛋白質(zhì)因位于反膠團(tuán)的內(nèi)部而受到反膠團(tuán)的保護(hù)。蛋白質(zhì)的分離純化——溶解度雙水相萃取技術(shù)ATPE（Aqueo11蛋白質(zhì)的分離純化——分子量蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì),并且不同蛋白質(zhì)的分子量大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開,并且不同分子量的蛋白質(zhì)也得到分離。常用方法透析超濾離心凝膠過濾蛋白質(zhì)的分離純化——分子量蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì),并且不同蛋12蛋白質(zhì)的分離純化——分子量透析將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液進(jìn)行分離。超濾利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過程。由于超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質(zhì)的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時(shí)要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果。這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與無機(jī)鹽為主的小分子分開，經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)用。在進(jìn)行鹽析或鹽溶后，這兩種方法除去引入的無機(jī)鹽。蛋白質(zhì)的分離純化——分子量透析這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子13蛋白質(zhì)的分離純化——分子量離心經(jīng)常和其它方法聯(lián)用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時(shí)，可利用離心進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度?？梢愿鶕?jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。。蛋白質(zhì)的分離純化——分子量離心14蛋白質(zhì)的分離純化——分子量凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一。原理是當(dāng)不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí),比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運(yùn)動(dòng)并最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。蛋白質(zhì)的分離純化——分子量凝膠過濾15蛋白質(zhì)分析技術(shù)課件16蛋白質(zhì)的分離純化——所帶電荷電泳在外電場的作用下,不處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子將向著與其電性相反的電極移動(dòng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦電泳雙向電泳離子交換層析是以離子交換劑為固定相,依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法帶有正電荷的陰離子交換樹脂帶有負(fù)電荷的陽離子交換樹脂。蛋白質(zhì)的分離純化——所帶電荷電泳17蛋白質(zhì)的分離純化——所帶電荷電泳在外電場的作用下,不處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子將向著與其電性相反的電極移動(dòng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦電泳雙向電泳離子交換層析是以離子交換劑為固定相,依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法帶有正電荷的陰離子交換樹脂帶有負(fù)電荷的陽離子交換樹脂。蛋白質(zhì)的分離純化——所帶電荷電泳18聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺聚合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。分子篩效應(yīng)調(diào)節(jié)濃度可控制孔徑大小與所帶電荷、分子量大小有關(guān)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺聚合形成19聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native）在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)。依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS）根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑（SDS即十二烷基磺酸鈉）。蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀?。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Na20聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺Tris-HCl緩沖系統(tǒng)，調(diào)節(jié)pH值。強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。SDS陰離子去污劑，去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。過硫酸銨（AP）、四甲基乙二胺（TEMED）AP催化單丙和雙丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED加速AP催化作用；聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺21聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）22聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）23聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）24蛋白質(zhì)的分離純化——所帶電荷電泳在外電場的作用下,不處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子將向著與其電性相反的電極移動(dòng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦電泳雙向電泳離子交換層析是以離子交換劑為固定相,依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法帶有正電荷的陰離子交換樹脂帶有負(fù)電荷的陽離子交換樹脂。蛋白質(zhì)的分離純化——所帶電荷電泳25等電聚焦電泳（IEF）利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在載體（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個(gè)pH梯度。電泳時(shí)每種蛋白質(zhì)遷移到等于其等電點(diǎn)（pI）的pH處時(shí)，此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負(fù)電荷，從而停止遷移形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。每種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，從而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。等電聚焦電泳（IEF）利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在載26等電聚焦電泳（IEF）等電聚焦電泳（IEF）27等電聚焦電泳（IEF）等電聚焦電泳（IEF）28蛋白質(zhì)的分離純化——所帶電荷電泳在外電場的作用下,不處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子將向著與其電性相反的電極移動(dòng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦電泳雙向電泳離子交換層析是以離子交換劑為固定相,依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法帶有正電荷的陰離子交換樹脂帶有負(fù)電荷的陽離子交換樹脂。蛋白質(zhì)的分離純化——所帶電荷電泳29雙向電泳（2-DE）第一向等電聚焦電泳：蛋白質(zhì)按照pI進(jìn)行分離第二向SDS-聚丙烯酰胺電泳：蛋白質(zhì)按照分子量進(jìn)行分離雙向電泳（2-DE）第一向等電聚焦電泳：蛋白質(zhì)按照pI進(jìn)行分30第一向：等電聚焦電泳第一向：等電聚焦電泳31第二向：SDS電泳第二向：SDS電泳32電泳結(jié)果電泳結(jié)果33蛋白質(zhì)的分離純化——所帶電荷電泳在外電場的作用下,不處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子將向著與其電性相反的電極移動(dòng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦電泳雙向電泳離子交換層析是以離子交換劑為固定相,依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法帶有正電荷的陰離子交換樹脂帶有負(fù)電荷的陽離子交換樹脂。蛋白質(zhì)的分離純化——所帶電荷電泳34蛋白質(zhì)分析技術(shù)課件35蛋白質(zhì)的分離純化——特殊親和性親和層析法利用蛋白質(zhì)與配基之間特異性又可逆的結(jié)合這一特性，對蛋白質(zhì)進(jìn)行層析分離的技術(shù)。常用配基抗原——抗體激素——受體蛋白酶——底物（抑制劑）層析載體常用瓊脂糖凝膠等。蛋白質(zhì)的分離純化——特殊親和性親和層析法36蛋白質(zhì)的分離純化——特殊親和性蛋白質(zhì)的分離純化——特殊親和性37蛋白質(zhì)濃度測定凱氏定氮法雙縮脲法酚試劑法（lowry法）紫外吸收法考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)濃度測定凱氏定氮法38蛋白質(zhì)濃度測定凱氏定氮法樣品與濃硫酸共熱，含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨與硫酸作用變成硫酸氨。再經(jīng)強(qiáng)堿分解釋放氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，總氮量減去非蛋白氮即得蛋白氮量，樣品中蛋白氮乘以6．25即得樣品蛋白量。靈敏度較低。蛋白質(zhì)濃度測定凱氏定氮法樣品與濃硫酸共熱，含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)39蛋白質(zhì)濃度測定雙縮脲法在堿性溶液中，雙縮脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)與二價(jià)銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有肽鍵(—CO-NH—)，可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，呈色強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比。測定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。蛋白質(zhì)濃度測定雙縮脲法在堿性溶液中，雙縮脲(H2N-CO-N40蛋白質(zhì)濃度測定酚試劑法在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物，即雙縮脲反應(yīng)。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。蘭色深淺度與蛋白質(zhì)量成正比。優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長，要精確控制操作時(shí)間，專一性較差，干擾物質(zhì)較多。檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5μg。通常測定范圍是20~250μg。蛋白質(zhì)濃度測定酚試劑法在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生41蛋白質(zhì)濃度測定紫外吸收法蛋白質(zhì)在280nm處有吸收高峰，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多（核酸、緩沖液等），酪氨酸和色氨酸含量不同的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。蛋白質(zhì)濃度測定紫外吸收法蛋白質(zhì)在280nm處有吸收高峰，其吸42蛋白質(zhì)濃度測定考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，?95nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。蛋白質(zhì)濃度測定考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈43蛋白質(zhì)濃度測定優(yōu)點(diǎn)操作簡便靈敏度高穩(wěn)定性好缺點(diǎn)不同蛋白質(zhì)測定存在一定偏差，標(biāo)準(zhǔn)品采用γ-球蛋白可減少偏差。要求樣品完全溶解。樣品不能回收。注意事項(xiàng)反應(yīng)時(shí)間過長會(huì)產(chǎn)生沉淀影響檢測，一般在10min內(nèi)完成測定。蛋白質(zhì)濃度測定優(yōu)點(diǎn)操作簡便靈敏度高穩(wěn)定性好缺點(diǎn)不同蛋白質(zhì)測定44蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)被檢測物是蛋白質(zhì)“探針”是抗體“顯色”用標(biāo)記的二抗。蛋白質(zhì)印跡(WesternBlot)是將電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)被檢測物是蛋白質(zhì)蛋45蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)原理蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上；固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變；以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)；再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)；經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)原理46蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)47蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)第一步：樣品準(zhǔn)備蛋白質(zhì)的提取、純化、定量蛋白質(zhì)變性（加熱)樣品緩沖液（指示劑、陰離子去污劑等）蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)第一步：樣品準(zhǔn)備蛋48蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)第二步：SDS制膠（分離膠、濃縮膠、加樣孔）加樣（緩慢均勻）電泳（指示劑的位置）蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)第二步：SDS-P49蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)第三步：轉(zhuǎn)膜“三明治”結(jié)構(gòu)膜正膠負(fù)、隔絕空氣、避免短路蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)第三步：轉(zhuǎn)膜“三明50蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)第四步：封閉第五步：一抗孵育第六步：二抗孵育第七步：顯色非特異性蛋白質(zhì)占據(jù)膜上沒有蛋白質(zhì)的位點(diǎn)，防止抗體吸附，形成假陽性。針對待測蛋白的特異性抗原抗體反應(yīng)帶有標(biāo)記集團(tuán)的二抗與一抗蛋白結(jié)合二抗所帶集團(tuán)決定顯色方法：酶顯色、化學(xué)發(fā)光、放射顯影、熒光。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)第四步：封閉第五步51蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)第八步：圖像分析第九步：數(shù)據(jù)處理蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（western-blot)第八步：圖像分析第52酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其53酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)抗原抗體結(jié)合原理，具有特異性。標(biāo)記抗體所連接的酶作用于底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，具有放大效應(yīng)。根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。靈敏特異快速簡單易于自動(dòng)化操作酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)抗原抗體結(jié)合原理，具有特異性。靈敏54酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體（免疫吸附物）酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）酶作用的底物（顯色劑）根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。55酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)常用酶及其底物酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)常用酶及其底物56酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)雙抗體（抗原）夾心法雙位點(diǎn)一步法間接法競爭法捕獲法ABS-ELISA法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)雙抗體（抗原）夾心法雙位點(diǎn)一步法間接法競爭法57酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)包被板標(biāo)準(zhǔn)品一抗酶標(biāo)抗體顯色液終止液洗滌液酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)包被板58酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)59酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)酶標(biāo)儀酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)酶標(biāo)儀60免疫沉淀利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合；再與蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育；離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)過洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白免疫沉淀利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。61免疫沉淀免疫沉淀62免疫沉淀免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。免疫沉淀免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitati63免疫沉淀免疫沉淀64蛋白質(zhì)分析技術(shù)課件65免疫沉淀優(yōu)點(diǎn)相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。靈敏度沒有親和色譜高。免疫沉淀優(yōu)點(diǎn)相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)66蛋白質(zhì)分析技術(shù)高效液相色譜質(zhì)譜分析蛋白芯片其他蛋白質(zhì)分析技術(shù)高效液相色譜67高效液相色譜高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析。高效液相色譜高效液相色譜是色譜法的一