免疫組化理論課

免疫組織化學(xué)基本技術(shù)（2）

武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室

薛敬玲副教授免疫組化技術(shù)操作并不困難，雖然染色過程包括很多步驟，但只要注意一些主要問題，就能完成一張質(zhì)量好的免疫組化切片。內(nèi)容1.染色前需注意的問題2.染色中需注意的問題

3.如何進(jìn)行科研設(shè)計(jì)免疫組化基本流程以石蠟組織為例sp法：

取材---固定---脫水---透明---浸蠟包埋---切片---烤片---染色開始，脫蠟---入水---修復(fù)---阻斷內(nèi)源性過氧化物酶---正常羊血清封閉---一抗---二抗---三抗---顯色染色前需注意的問題染色中應(yīng)注意的問題一、脫蠟和水化

免疫組化的脫蠟步驟與常規(guī)H&E脫蠟步驟相同，免疫組化實(shí)驗(yàn)室中脫蠟需與H&E常規(guī)脫蠟分離，以保證脫蠟徹底，否則可能導(dǎo)致染色結(jié)果的異常。二、抗體選擇

首先確定一抗種屬來源能否適應(yīng)標(biāo)本來源（人或動(dòng)物組織），能否適應(yīng)標(biāo)本處理形式（冰凍、石蠟），一抗單克隆抗體（鼠、兔）和多克隆抗體（兔、馬、羊等）及二，三抗的配套連接，不同方法連接方式不同（S-P、二步法等），購買商品化抗體應(yīng)盡量購買原液，質(zhì)量高，保存時(shí)間長，而即用型抗體則現(xiàn)買現(xiàn)用，不可長期保存。多抗和單抗的比較均一性，單抗的均一性很強(qiáng)穩(wěn)定性，單抗的穩(wěn)定性較差特異性，單抗的特異性強(qiáng)重復(fù)性，單抗的重復(fù)性好主要有兩大類：1、多克隆抗體：為針對(duì)多個(gè)抗原決定簇的抗體，為產(chǎn)生抗體的動(dòng)物血清或免疫球蛋白。2、單克隆抗體：為一個(gè)B淋巴細(xì)胞分化增殖產(chǎn)生的抗體，可識(shí)別有限的抗原決定簇，特異性強(qiáng)?？贵w的稀釋方法直接測定法從以上結(jié)果分析，可以選擇1:200~1:400之間的濃度

抗體的最佳稀釋度

由于各種抗體效價(jià)不同，組織中抗原強(qiáng)弱不一，應(yīng)根據(jù)不同情況作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以取得中等陽性稀釋度為最佳，因其既適合于抗原性強(qiáng)和含量多的標(biāo)本，也可用于抗原性弱的標(biāo)本。抗體滴片技術(shù)

所滴的抗體應(yīng)與切片上的組織剛好吻合。滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。要領(lǐng)：甩凈組織周圍的水?？贵w滴片圖示：三、抗原修復(fù)

常規(guī)甲醛固定的石蠟切片標(biāo)本在固定過程中會(huì)形成醛鍵，導(dǎo)致蛋白交聯(lián)封閉了組織中的部分抗原決定簇，染色前需進(jìn)行處理，打開醛鍵暴露抗原，增加細(xì)胞和組織的通透性，以使抗體和抗原最大限度結(jié)合，提高免疫組化檢測陽性率，達(dá)到能真實(shí)反映該組織蛋白表達(dá)水平或抗原含量?？乖迯?fù)有酶消化、微波修復(fù)、高壓處理等。

1、微波修復(fù)

本實(shí)驗(yàn)室微波修復(fù)應(yīng)用最多，特點(diǎn)是簡單、有效，主要根據(jù)微波發(fā)射高頻能量，組織經(jīng)微波幅射后，會(huì)加速組織內(nèi)部分子高速運(yùn)動(dòng)，抗原可完全被暴露出來，用于漿或部分核抗原，膜抗原不用或短時(shí)間應(yīng)用。在0.01MPH6.0檸檬酸緩沖液微波修復(fù)時(shí)，溫度控制在95-100℃之間維持10分鐘，不足或超過100℃達(dá)不到抗原修復(fù)最佳效果。子宮內(nèi)膜PR染色，修復(fù)良好子宮內(nèi)膜PR染色，修復(fù)不足2、酶消化

其作用是以化學(xué)的方式使醛鍵斷裂，暴露抗原決定族，增加細(xì)胞和組織的通透性，以便抗體與抗原最大限度的結(jié)合，增強(qiáng)特異性染色，避免非特異性染色，注意有些抗原顯示必須先行消化，有些不需要反而破壞抗原性，使陽性率下降，須消化的組織或細(xì)胞抗原，也要視抗原在切片中的封閉程度而定。對(duì)某些組織抗原經(jīng)一種酶消化后，可能結(jié)果仍不理想，此時(shí)可采用雙消化法，消化的時(shí)間與固定的時(shí)間成反比。胰蛋白酶，用于胞漿抗原，此酶較溫和，濃度及消化時(shí)間易控制，常用0.05%~0.1%,PH7.8,37℃消化20~30′或更長，微波37℃可短時(shí)消化。胃蛋白酶，用于間質(zhì)抗原，常用0.2%PH2.5左右，消化20~30′或更長，消化后切片應(yīng)充分洗滌，否則對(duì)組織中抗原會(huì)進(jìn)行緩慢消化，破壞組織結(jié)構(gòu)3、高壓處理家用壓力鍋，大小尺寸根據(jù)需要而定，1000W電爐，多用于核抗原修復(fù)，針對(duì)微波修復(fù)多陰性，進(jìn)行高壓處理為陽性，如p27、p21WAP1、PR、Ki67效果好。將1500ml~3000ml的檸檬酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(shí)（約加熱5~6分鐘后），計(jì)時(shí)1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。加熱處理后免疫組化的染色敏感度大幅度地提高，其機(jī)理推測可能是加熱打開了組織抗原因福爾馬林固定所引起的抗原決定簇的交聯(lián)，但機(jī)理目前仍然還不是十分清楚。4.抗原修復(fù)液的選擇

加熱抗原修復(fù)緩沖液有多種，如檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）,Tris(pH7-8),EDTA(pH8.0)等,目前首選檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），優(yōu)點(diǎn)是染色背景清晰，適合于大多數(shù)抗體,Tris和EDTA兩種修復(fù)液對(duì)部分抗原修復(fù)效果較強(qiáng)，但其染色背景同時(shí)加深，如使用不當(dāng)易造成假陽性結(jié)果的判斷。值得注