人感染豬鏈球菌病采樣與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)-廣東

人感染豬鏈球菌標(biāo)本采集

和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所

2005年8月廣州概述鏈球菌是化膿球菌中的一大類(lèi)常見(jiàn)細(xì)菌，為鏈狀排列的革蘭氏陽(yáng)性球菌。分為致病性和非致病性?xún)深?lèi)。本菌廣泛分布于自然界：水、乳、塵埃，人及動(dòng)物的糞便以及健康人的鼻咽部。引起化膿性炎癥、猩紅熱、丹毒、產(chǎn)褥熱、以及鏈球菌變態(tài)反應(yīng)性疾病。形態(tài)與染色鏈球菌為球形或卵圓形，呈單個(gè)、成對(duì)或數(shù)個(gè)排列的短鏈，也可排列成串珠狀長(zhǎng)鏈。一般無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)（D群某些菌株除外），不形成芽胞。。革蘭氏染色一般為陽(yáng)性，陳舊培養(yǎng)物則多為陰性。培養(yǎng)特性致病鏈球菌在含血清和新鮮血的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。一般常用新鮮血瓊脂培養(yǎng)觀察溶血現(xiàn)象。本菌為需氧或兼性厭氧，但在無(wú)氧時(shí)溶血明顯。培養(yǎng)最適溫度為37℃。菌落細(xì)小，濕潤(rùn)，光滑，圓形，邊緣整齊。致病性鏈球菌多屬于溶血性鏈球菌（β溶血）有的菌株在病料中或含血清的培養(yǎng)基內(nèi)能形成菌膜?？乖Y(jié)構(gòu)本菌具有一種特異性的多糖類(lèi)抗原，又稱(chēng)為C抗原。用溫?zé)嵯←}酸浸出的這種抗原與特異性抗血清作沉淀反應(yīng)，可將溶血性鏈球菌進(jìn)行血清學(xué)分類(lèi)。核蛋白抗原（P抗原），此抗原無(wú)特異性。表面蛋白抗原，具有型特異性。分類(lèi)按蘭氏分類(lèi)，目前確定的血清群有從A至V共20個(gè)群（其中缺I、J群）。每個(gè)群結(jié)合生化和培養(yǎng)特性又分為若干型或亞型。幾乎所有的菌群，都能從病豬體內(nèi)分離得到。分類(lèi)根據(jù)溶血程度，將鏈球菌屬分為：α-溶血性鏈球菌,菌落周?chē)胁菥G色溶血環(huán)，故稱(chēng)為草綠色鏈球菌。β-溶血性鏈球菌，菌落周?chē)袑挾该鞯娜苎h(huán)，故稱(chēng)為溶血性鏈球菌。γ-溶血性鏈球菌，菌落周?chē)鸁o(wú)溶血環(huán)，故稱(chēng)為不溶血性鏈球菌。

（1）

α-溶血性鏈球菌（草綠色鏈球菌）α溶血代表菌所致疾病肺炎鏈球菌

肺炎鏈球菌大葉性肺炎、敗血癥、腦膜炎、嬰幼兒急性中耳炎緩癥鏈球菌群血液鏈球菌條件致病菌副血鏈球菌

格登鏈球菌

嵴鏈球菌

口腔鏈球菌

緩癥鏈球菌TSS咽峽炎鏈球菌群咽峽炎鏈球菌

星群鏈球菌

中間鏈球菌深部膿腫變異鏈球菌群變異鏈球菌

遠(yuǎn)緣鏈球菌

倉(cāng)鼠鏈球菌

大鼠鏈球菌

汗毛鏈球菌

牛鏈球菌

敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎唾液鏈球菌

少酸鏈球菌

#豬鏈球菌（Lancefield分型可分為R、S、T群）豬鏈球菌I型

豬鏈球菌II型(屬R群)STSS(鏈球菌中毒性休克綜合癥)、腦膜炎#豬鏈球菌：在綿羊血平板上表現(xiàn)為α溶血，而在馬血平板上為β溶血。α-溶血性鏈球菌（草綠色鏈球菌）

#豬鏈球菌：在綿羊血平板上表現(xiàn)為α溶血，而在馬血平板上為β溶血。

A化膿性鏈球菌咽部、皮膚、直腸對(duì)人類(lèi)致病的90%為A群，所致疾病有：咽峽炎、猩紅熱、膿皰病、風(fēng)濕熱、急性腎小球腎炎、壞死性筋膜炎、敗血癥、毒素休克樣綜合征等。B無(wú)乳鏈球菌咽部、皮膚、生殖道、胃腸道為新生兒嚴(yán)重感染的病原菌，如：肺炎、敗血癥和腦膜炎C#停乳鏈球菌種似馬鏈球菌亞種咽部、皮膚、生殖道、胃腸道類(lèi)似于化膿性鏈球菌，可造成嚴(yán)重感染如：咽峽炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、腎小球腎炎、腦膜炎、化膿性關(guān)節(jié)炎及皮膚感染等。D腸球菌

F咽峽炎鏈球菌口腔

G#停乳鏈球菌種似馬鏈球菌亞種咽部、皮膚、生殖道、胃腸道同C群。注：a.因咽峽炎鏈球菌和小菌落的β溶血性鏈球菌(小菌落C\G\F)有共同的抗原成分，因而將它們均化為咽峽炎鏈球菌。b.停乳鏈球菌種似馬鏈球菌亞種包括大菌落的C、G群。

β-溶血性鏈球菌致病性化膿性鏈球菌是蘭氏A群中唯一對(duì)人類(lèi)致病的細(xì)菌，但A群鏈球菌對(duì)動(dòng)物的致病性不強(qiáng)。引起豬病并偶爾經(jīng)傷口感染人的鏈球菌主要有：F群的咽峽炎鏈球菌，L、R、S、T、U、V群鏈球菌等。國(guó)外近二十年報(bào)道較多，引起豬病并偶爾感染人，導(dǎo)致人重癥感染的，主要是豬鏈球菌II型，它能引起人和豬的腦膜炎、敗血癥和關(guān)節(jié)炎，還可引起人的知覺(jué)性耳聾和中毒性休克綜合征等。豬鏈球菌所致的鏈球菌中毒性休克綜合征病例的主要臨床表現(xiàn)突發(fā)高熱，最高體溫達(dá)42℃。伴有頭痛及腹瀉等胃腸道癥狀。皮膚瘀點(diǎn)、瘀斑，主要分布于四肢及頭面部,不高出皮膚,無(wú)潰瘍等。最終致休克、少尿、死亡。

豬鏈球菌腦膜炎型綜合征病例的主要臨床表現(xiàn)頭痛。高熱。均表現(xiàn)為腦膜刺激癥狀。未見(jiàn)腹瀉等胃腸道癥狀。少見(jiàn)瘀點(diǎn)和瘀斑、休克、少尿等。潛伏期均在2日以?xún)?nèi),多為幾個(gè)小時(shí)。

標(biāo)本采集-準(zhǔn)備工作無(wú)菌封閉性好的試管(最好使用負(fù)壓采血管)?？梢郧宄?biāo)記且標(biāo)記不易脫落的記號(hào)筆。詳細(xì)記錄被采樣病人的背景?？梢苑奖悴杉M織標(biāo)本的無(wú)菌容器。無(wú)菌的剪刀、鑷子和手術(shù)刀。血平皿和血培養(yǎng)瓶。樣品種類(lèi)現(xiàn)住院病人不抗凝全血（同時(shí)做血平皿或血培養(yǎng)瓶的床邊接種培養(yǎng)）。新住院病人治療前不抗凝全血（同時(shí)做血平皿或血培養(yǎng)瓶的床邊接種培養(yǎng)）。分別采集發(fā)病4-7天、10-16天的不抗凝全血。盡量采集腦脊液標(biāo)本（同時(shí)做血平皿或血培養(yǎng)瓶的床邊接種培養(yǎng)）。尸體解剖應(yīng)無(wú)菌采集肝、脾、心血、胸（腹）水。病死豬也可進(jìn)行解剖，取肝、脾、腎、心血。標(biāo)本采集程序記錄病人的姓名、家庭住址、發(fā)病日期、采樣日期、性別、年齡等資料。無(wú)菌抽取血液5-10ml和適量腦脊液標(biāo)本置于無(wú)菌試管或者負(fù)壓采血管中。

注：采集的同時(shí)在床邊接種血平皿或者血培養(yǎng)瓶，然后放置于37℃培養(yǎng)，如有菌落生長(zhǎng)根據(jù)條件應(yīng)及時(shí)做初步鑒定，菌株送省CDC做進(jìn)一步鑒定確認(rèn)。標(biāo)本采集-注意事項(xiàng)在標(biāo)本采集過(guò)程中，注意使用一次性隔離服、手套、防護(hù)口罩等防護(hù)措施。在標(biāo)本采集過(guò)程中,嚴(yán)格采取預(yù)防措施，防止針頭等銳器刺傷。嚴(yán)格的無(wú)菌操作,防止污染標(biāo)本。

標(biāo)本運(yùn)輸以及保存所有的原始標(biāo)本在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中應(yīng)置于安全可靠容器中。血清和腦脊液標(biāo)本應(yīng)在帶有冰袋或者冰排的泡沫箱中運(yùn)輸。檢測(cè)前可將標(biāo)本暫放4-8℃冰箱，檢測(cè)后置-20℃冰箱保存。增菌液和培養(yǎng)皿可常溫送檢和保存。

豬鏈球菌檢驗(yàn)程序

病人檢樣（腦脊液，血液，關(guān)節(jié)液）增菌培養(yǎng)（腦心肉湯）革蘭氏染色（有G+成對(duì)球菌）

豬鏈球菌檢驗(yàn)程序(續(xù))羊血瓊脂平板（37℃，5%CO2，24h）α溶血(偶而也有弱β溶血)

PCR檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)生化鑒定分離步驟和程序血，腹水，腦脊液或者是尸檢標(biāo)本的腹水、心包血接種于血平板或者血培養(yǎng)瓶,肝臟、脾臟組織直接接種于血平板,如果是污染標(biāo)本,則要接種于選擇增菌培養(yǎng)液（含15微克/毫升多粘菌素B，30微克/毫升萘啶酮酸的腦心培養(yǎng)基）進(jìn)行增菌,5%CO2培養(yǎng)箱或者燭缸中培養(yǎng)。

豬鏈球菌的菌落特點(diǎn)在綿羊血平板上表現(xiàn)為α溶血，而在馬血平板上為β溶血。在綿羊血平板上為灰白色、凸起、光滑、較小,菌落周?chē)幸粚硬菥G色溶血環(huán),屬α溶血。

豬鏈球菌革蘭染色特點(diǎn)剛分離時(shí)細(xì)菌形態(tài)為典型的革蘭陽(yáng)性鏈球菌,多數(shù)為單個(gè)、成雙,少數(shù)成短鏈，有的鏈長(zhǎng)達(dá)二十多個(gè)。陳舊培養(yǎng)后細(xì)菌染色形態(tài)發(fā)生變化,多為革蘭陰性球桿球,不成鏈,給細(xì)菌鑒定帶來(lái)一定困難。因此剛分離到的細(xì)菌形態(tài)觀察對(duì)細(xì)菌鑒定十分重要。

豬鏈球菌生長(zhǎng)特點(diǎn)葡萄糖肉湯上呈絮狀生長(zhǎng),沉于管底，美蘭牛乳、40%膽汁肉湯和6.5%氯化鈉肉湯不生長(zhǎng)。

豬鏈球菌毒力試驗(yàn):人源與豬源菌株均對(duì)小白鼠不敏感,對(duì)家兔和豬敏感,并導(dǎo)致死亡。病理所見(jiàn)為小腸水腫嚴(yán)重,腸壁變薄,肝腎腫大,瘀血,肺部出血,并從心腔血中可檢測(cè)到與接種菌株相同的鏈球菌。

豬鏈球菌生化反應(yīng)普通實(shí)驗(yàn)室可以重點(diǎn)做VP(-),七葉苷水解試驗(yàn)(+)，6.5%的氯化鈉生長(zhǎng)試驗(yàn)(-)，45度﹑10度生長(zhǎng)試驗(yàn)(-)，膽汁耐受（麥康凱培養(yǎng)基）(-),可初步認(rèn)為豬鏈球菌?？伤徒坏接袟l件的單位做進(jìn)一步鑒定。

具有參考價(jià)值的生化反應(yīng)項(xiàng)目有：

生長(zhǎng)特性10℃45℃6.5%NaClPH9.6麥康凱培養(yǎng)基（膽汁耐受）

不生長(zhǎng)不生長(zhǎng)不生長(zhǎng)不生長(zhǎng)不生長(zhǎng)

發(fā)酵試驗(yàn)棉子糖RAF乳糖LAC甘露糖MNS山梨醇SOR阿拉伯糖ARA核糖RBS++————葡糖INU甘露醇MAN丙酮酸PRV甘油Glycerol松三糖melezitose馬尿酸鹽hippurate+—————

API生化試驗(yàn)API20Strept生化系統(tǒng)可作為生化鑒定豬鏈球菌的一個(gè)快速方法，結(jié)果鑒定率可高達(dá)99.8%，但仍需要血清凝集試驗(yàn)結(jié)果加以證實(shí)。

脂肪酸成份