Takara 實(shí)驗(yàn)技能講座之Western blot

蛋白相關(guān)產(chǎn)品介紹--WesternBlot上海皓嘉科技發(fā)展有限公司什么是Westernblot？2

免疫印跡（immunoblotting）又稱(chēng)蛋白質(zhì)印跡（westernblot），它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合，檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白質(zhì)的方法。westernblot是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。用途：常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白的豐度進(jìn)行定性和半定量分析。HRP標(biāo)記的二抗HRP底物(Luminol)化學(xué)發(fā)光

信號(hào)Westernblot步驟3

樣品制備4

細(xì)胞裂解蛋白純化蛋白定量細(xì)胞裂解5

xTractorBuffer635656xTractorBufferKit635623裂解細(xì)胞種類(lèi)：Bacterialcells、MammaliancellsYeastcells、Baculovirus-infectedcellsYeastProteinExtractionReagent9780酵母總蛋白質(zhì)提取試劑簡(jiǎn)捷、快速的提取酵母菌總蛋白質(zhì)的試劑蛋白酶抑制劑ProteoGuard?EDTA-FreeProteaseInhibitorCocktail635672Calpastatin7316細(xì)胞裂解液Calpain競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑細(xì)胞裂解：比較常用超聲波破碎法和酶溶破碎法。6

蛋白純化高特異性的Co2+樹(shù)脂：TALON系列高產(chǎn)量的Ni2+樹(shù)脂：His60Ni系列6

組氨酸標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)的純化蛋白定量方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說(shuō)明產(chǎn)品紫外吸收法20-100mg/ml快速

5-10分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌呤和嘧啶；各種核苷酸干擾物質(zhì)較多Bradford法1-1000μg/ml快速

5分鐘考馬斯染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后，溶液的顏色發(fā)生變化。這種顏色的變化與溶液中的蛋白質(zhì)濃度成正比。表面活性劑：TritonX-100；SDS操作簡(jiǎn)便；可對(duì)含有還原劑的樣品進(jìn)行測(cè)定；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。TaKaRaBradfordProteinAssayKit（T9310A）BCA法0.02-2mg/ml較快速

30分鐘內(nèi)二價(jià)銅離子(Cu+2)在堿性條件下被蛋白質(zhì)的肽鍵還原成一價(jià)銅離子(Cu+)，兩個(gè)分子的BCA絡(luò)合一個(gè)一價(jià)銅離子(Cu+)，形成一種在562nm處有強(qiáng)吸收值的紫色復(fù)合物。螯合劑、還原劑：EDTA、EGTA、β-巰基乙醇不受蛋白質(zhì)種類(lèi)的影響；對(duì)表面活性劑的干擾影響小。TaKaRaBCAProteinAssayKit（T9300A）7

8

相關(guān)產(chǎn)品方法名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）特點(diǎn)BCA法TaKaRaBCAProteinAssayKitT9300A500次700不受蛋白質(zhì)種類(lèi)的影響，在0.02～2mg/ml濃度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)濃度與吸光度值成線性關(guān)系；對(duì)表面活性劑的干擾影響??；2種操作方法（標(biāo)準(zhǔn)操作方法；低濃度測(cè)定操作方法）Bradford法TaKaRaBradfordProteinAssayKitT9310A500次500操作簡(jiǎn)便，可快速地對(duì)濃度范圍在1～1,000μg/ml的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行定量。可對(duì)含有還原劑的樣品進(jìn)行測(cè)定；2種操作方法（標(biāo)準(zhǔn)操作方法；低濃度測(cè)定操作方法）8

9

Westernblot步驟9

電泳電泳(SDS)10

蛋白分子量膠濃度

40kDa～80kDa12.5%小于40kDa15%大于80kDa10%凝膠的選擇樣品制備還原處理的樣品和非還原處理的樣品同時(shí)電泳分子量Marker的選擇預(yù)染蛋白marker普通蛋白marker設(shè)立對(duì)照樣品設(shè)立比對(duì)樣品空質(zhì)粒對(duì)照樣品、整個(gè)菌液、上清、沉淀對(duì)比樣品與檢測(cè)樣品同時(shí)電泳SDS電泳中蛋白質(zhì)分子所帶的電荷差異對(duì)電泳的影響是微乎其微的，可以忽略不計(jì)。SDS電泳中白質(zhì)的遷移速度與其分子量大小成反比，分子量越小，遷移速度越快。11

相關(guān)產(chǎn)品11

CLEARLYStainedProteinLadder3454ACLEARLYProteinLadder(Unstained)3453ATris-Glycine-SDSBuffer(TG-SDS)Powder,pH8.3T9101Tris-GlycineBuffer(TG)Powder,pH8.3T9102TaKaRaCBBProteinSafeStainT9320A以CBB為主要成分制備的蛋白質(zhì)高靈敏度染色液迅速（染色5分鐘后可確認(rèn)蛋白質(zhì)片段）使用安全不含有害物質(zhì)甲醇和乙酸可使用去離子水進(jìn)行脫色2×ProteinSDSPAGELoadingBuffer91724×ProteinSDSPAGELoadingBuffer9173上樣loading預(yù)染Marker與非預(yù)染Marker電泳緩沖液染色液12

電泳儀12

垂直電泳系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：/genepro/depshow.asp?id=1437雙向電泳系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：/genepro/depshow.asp?id=1438Westernblot步驟13

轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜14

膜的選擇常用的轉(zhuǎn)移膜主要有PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）和硝酸纖維素膜。PVDF膜與目的蛋白的結(jié)合能力高，靈敏度高，不易破碎，同時(shí)也適用于再次標(biāo)記(Reprobing)（為了增加PVD膜的親水性，膜使用前需浸泡在甲醇中）。而硝酸纖維素膜雖不需要浸泡但極易破碎。☆膜標(biāo)記好正反面轉(zhuǎn)膜緩沖液Tris-GlycineBuffer(TG)Powder,pH8.3T9102轉(zhuǎn)膜：蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。15

轉(zhuǎn)膜儀（轉(zhuǎn)印儀）15

水平半干轉(zhuǎn)印系列產(chǎn)品詳情請(qǐng)見(jiàn)：/genepro/depshow.asp?id=1440轉(zhuǎn)膜儀的選擇分為半干轉(zhuǎn)膜儀和濕電轉(zhuǎn)膜儀。濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜效率高且轉(zhuǎn)膜均勻，但使用的電轉(zhuǎn)液液量多，需邊冷卻邊轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間長(zhǎng)（過(guò)夜）。而半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜時(shí)間短，只需要少量的電轉(zhuǎn)液。Westernblot步驟16

封閉封閉封閉劑的選擇有時(shí)特定的封閉劑達(dá)不到預(yù)期的封閉效果。另外封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)抑制抗原抗體反應(yīng)及標(biāo)記抗體的酶活性，應(yīng)準(zhǔn)備幾種封閉劑進(jìn)行點(diǎn)雜交預(yù)研討實(shí)驗(yàn)選擇合適的封閉劑。17

☆注意避免讓膜變干封閉的作用：為了防止蛋白檢測(cè)用抗體非特異性與膜結(jié)合，對(duì)未結(jié)合蛋白的膜區(qū)域進(jìn)行封閉很重要。18

相關(guān)產(chǎn)品18

WesternBLoTBlockingBuffer(FishGelatin)T7131AWesternBLoTBlockingBuffer(ProteinFree）T7132A在TBS-TBuffer含有魚(yú)源明膠的封閉緩沖液。同哺乳動(dòng)物來(lái)源的奶粉和BSA相比，不會(huì)與哺乳動(dòng)物來(lái)源抗體出現(xiàn)非特異性交叉反應(yīng)?？梢种票尘埃軌蛎鞔_地檢測(cè)出抗原。不含蛋白質(zhì)（ProteinFree）的化學(xué)成分封閉緩沖液。同一般的脫脂奶粉相比，可提高檢測(cè)靈敏度。有效地用于檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)。19

洗滌洗滌液的選擇一般使用PBS或TBS緩沖液。根據(jù)目的蛋白和檢測(cè)試劑選擇洗滌液。選擇不含抑制HRP的疊氮化鈉的洗滌液比較好。磷酸化蛋白質(zhì)適合使用TBS緩沖液或含Tween20的TBS緩沖液。19

TrisBufferedSalinewithTween?20(TBS-T)Tablets,pH7.6T9142

ELISA、WesternBlotting的清洗Buffer或封閉Buffer。

抗體稀釋。TrisBufferedSaline(TBS)Tablets,pH7.6T9141

ELISA、WesternBlotting、免疫組織染色用的清洗Buffer。

樣品稀釋。PhosphateBufferedSalinewithTween?20(PBS-T)Tablets,pH7.4T9183

ELISA、WesternBlotting的清洗Buffer或封閉Buffer。

抗體稀釋。PhosphateBufferedSaline(PBS)Tablets,pH7.4T9181

ELISA、WesternBlotting、免疫組織染色用的清洗Buffer。

清洗細(xì)胞。

樣品稀釋。WesternBlotting操作過(guò)程中需洗膜，洗膜可除去未反應(yīng)的試劑，抑制背景。20

Westernblot步驟20

一抗孵育二抗孵育一抗孵育一抗的選擇抗體有識(shí)別1個(gè)抗原決定簇的單克隆抗體和識(shí)別多個(gè)抗原決定簇的多克隆抗體。另外有的抗體識(shí)別一級(jí)結(jié)構(gòu)，有的抗體識(shí)別立體結(jié)構(gòu)，后者不能與變性或還原的蛋白質(zhì)結(jié)合。制備抗體時(shí)，如果免疫原是變性蛋白，那么制備的抗體只能與變性蛋白結(jié)合，不能與天然蛋白質(zhì)結(jié)合。用于WesternBlotting的一抗一般都有銷(xiāo)售。購(gòu)買(mǎi)抗體時(shí)要考慮以上幾點(diǎn)，選擇抗體時(shí)，對(duì)同一個(gè)抗原的不同類(lèi)型抗體在產(chǎn)品數(shù)據(jù)上進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查后再購(gòu)買(mǎi)，盡量使用特異性高的單克隆抗體。反應(yīng)方法減少失敗的最好方法是將高度稀釋的低濃度抗體溶液添加到托盤(pán)中，放入膜后，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜孵育。如果抗體使用量有限制，建議使用雜交袋，使用雜交袋時(shí)要確保不能有氣泡。21

使用一抗進(jìn)行目的蛋白的檢測(cè)。抗體查詢22

http://www.takara-bio.co.jp/antibody_search/antibody_search.php抗體種類(lèi)細(xì)胞間連接、鈣粘著蛋白抗體細(xì)胞外基質(zhì)關(guān)聯(lián)骨代謝關(guān)聯(lián)血小板關(guān)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)等疾病相關(guān)抗體（IBL）His標(biāo)簽抗體二抗孵育二抗的選擇可從不同宿主獲得的二抗，如果背景較高，使用另一種宿主的二抗可減少背景。還銷(xiāo)售宿主以外的對(duì)動(dòng)物種屬來(lái)源血清蛋白進(jìn)行吸收操作的抗體。確認(rèn)動(dòng)物種屬后根據(jù)檢測(cè)方法選擇合適的抗體。一般使用HRP（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的二抗進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的方法。其它還有使用AP（堿性磷酸酶）標(biāo)記抗體（對(duì)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)）、熒光物質(zhì)及放射性同位素標(biāo)記的二抗。23

使用二抗進(jìn)行一抗的檢測(cè)。二抗孵育前應(yīng)進(jìn)行點(diǎn)雜交預(yù)實(shí)驗(yàn)，研討二抗的正確使用量。Westernblot快速檢出試劑（二抗替代物）

--WesternBLoTRapidDetectv2.024

短時(shí)間內(nèi)有效的進(jìn)行抗體反應(yīng)，可以使用Rapid操作方法提高檢出感度，

IgGDetector標(biāo)

記50個(gè)HRP分子

增加信號(hào)強(qiáng)度。動(dòng)物種HRP標(biāo)記二抗替代物（檢測(cè)MouseIgG時(shí)需要使用Enhancer，不能替代goatIgG、humanIgG3二抗）WesternBLoTRapidDetectv2.0T7122A50次3170元Westernblot步驟25

檢測(cè)化學(xué)發(fā)光

檢測(cè)檢測(cè)(化學(xué)發(fā)光?顯色)按照各試劑的操作流程進(jìn)行重復(fù)操作，研討最佳實(shí)驗(yàn)條件。將轉(zhuǎn)膜后的膜放置在保鮮膜上，將檢測(cè)試劑滴加在膜上，確保試劑均勻覆蓋在膜上。因目的蛋白的濃度和使用的抗體濃度不同，膠片曝光條件也不同，因此要進(jìn)行預(yù)研討實(shí)驗(yàn)。在發(fā)光持續(xù)時(shí)間內(nèi)可改變膠片曝光條件進(jìn)行多次檢測(cè)。26

檢測(cè)方法有化學(xué)發(fā)光法和顯色法。顯色法操作簡(jiǎn)便，但化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法檢測(cè)靈敏度高，一般經(jīng)常使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)法是利用基質(zhì)被二抗的HRP分解時(shí)生成的有色物對(duì)目的蛋白的有無(wú)及蛋白量進(jìn)行檢測(cè)。相關(guān)產(chǎn)品—化學(xué)發(fā)光27

產(chǎn)品名稱(chēng)Code包裝量?jī)r(jià)格（元）檢出靈敏度概要檢測(cè)方法WesternBLoTChemiluminescenceHRPSubstrateT7101A250ml1,600pg級(jí)其他公司同等產(chǎn)品發(fā)光強(qiáng)度比較XfilmWesternBLoTQuantHRPSubstrateT7102A100ml2,050低pg級(jí)發(fā)光持續(xù)而穩(wěn)定CCD成像、XfilmWesternBLoTHyperHRPSubstrateT7103A100ml2,500中fg級(jí)檢出靈敏度的比較CCD成像、XfilmWesternBLoTUltra

SensitiveHRPSubstrateT7104A100ml4,130低fg級(jí)檢出靈敏度和抗體用量CCD成像、Xfilm28

發(fā)光強(qiáng)度比較28

WesternBLoTChemiluminescentHRPSubstrate（Code：T7101A）同其他公司同等HRP反應(yīng)基質(zhì)制品比較，利用HRP標(biāo)記二抗（39~5,000pg）進(jìn)行slotblot檢測(cè)發(fā)光信號(hào)?？贵w：GoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated膜：nitrocellulose使用WesternBLoTChemiluminescentHRPSubstrate可高靈敏度地檢測(cè)出清晰的信號(hào)（曝光時(shí)間：5秒、Xfilm。本公司數(shù)據(jù)）明亮的發(fā)光信號(hào)29

發(fā)光持續(xù)而穩(wěn)定29

穩(wěn)定發(fā)光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)使用WesternBLoTQuantHRPSubstrate（制品Code：T7102A）利用slotblot方法可以確認(rèn)發(fā)光的持續(xù)性sample：人Transferrin，200ng起始2倍梯度稀釋一抗：Goatanti-HumanTransferrinAffinityPurified二抗：AffinityPurifiedAntibody-Anti-GoatIgG(H+L)Peroxidaselabeled從反應(yīng)開(kāi)始90min，發(fā)光還持續(xù)穩(wěn)定，一次反應(yīng)也可重復(fù)進(jìn)行曝光檢測(cè)。本公司數(shù)據(jù)30

檢出靈敏度比較30

使用少量抗體，可進(jìn)行高靈敏度檢出HeLa細(xì)胞裂解液梯度稀釋后作為樣品，改變抗體使用量，western

blot檢測(cè)出GAPDH。sample：HeLa細(xì)胞裂解液總蛋白，從10μg起始2倍梯度稀釋一抗：Anti-Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase,clone6C5（1mg/ml）二抗：PierceGoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated（0.8mg/ml）<抗體的稀釋倍數(shù)>使用WesternBLoTHyper

Substrate（T7103A）更少的抗體量也可以檢出本公司數(shù)據(jù)31

檢出靈敏度和抗體使用量Hela細(xì)