化學半合成法分離純化長春瑞濱粗產物

化學半合成法分離純化長春瑞濱粗產物

長春瑞林堿（ivl）也被稱為去甲基長春堿、異長春堿、失碳長春堿或脫甲基長春堿。1989年，法國皮爾法比首次生產并上市。長春瑞濱作為一種化學半合成的長春花類生物堿抗腫瘤藥物,具有抗癌活性高、抗瘤譜廣、毒副作用小等特點,目前臨床上已用單藥或聯(lián)合用藥治療非小細胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、惡性淋巴瘤等。合成長春瑞濱所用的原料主要是天然提取的長春堿,由于其中含有很多結構類似的生物堿,加之從長春堿到長春瑞濱至少需要經過3步復雜的有機反應,過程中往往伴生出許多新的雜質,因此分離純化工作一直是規(guī)?；a長春瑞濱原料藥的難點之一。目前國內外報道的純化制備長春瑞濱的方法主要是通過反復多次過硅膠柱或氧化鋁柱,再結合重結晶技術獲得原料藥,但是這些方法在實踐中也存在一些問題。一是需要多次過柱才能達到較好的純化目的;二是硅膠或氧化鋁的吸附能力較強,目標產物易發(fā)生不可逆吸附,因而收率較低;三是反復多次過柱耗時、耗費大量有機溶劑,引起環(huán)境污染。另外填裝好的硅膠柱一般很難重復使用,反復填柱不僅增加了工人的勞動強度,原材料成本也相應提高。利用反相聚苯乙烯填料MCI-GELCHP-20對中草藥有效成分進行分離純化顯示了良好的應用潛力。在前期實驗中筆者發(fā)現(xiàn)該類填料能將多個結構相似的長春花類生物堿很好的分離,但由于該類高效能的商品化填料目前價格較貴,且需要消耗大量色譜純的有機流動相,運行成本較高。如果直接使用反應后的粗提物,易造成填料變性、失效。所以在利用MCI-GELCHP-20填料精制長春瑞濱之前,有必要對合成的長春瑞濱粗品進行初分離。實驗中采用正相快速干柱硅膠與反相聚苯乙烯柱組合,分離純化長春瑞濱,為研究開發(fā)出一種高效、實用的分離純化長春瑞濱新技術提供依據(jù)。1實驗部分1.1填料及分析純Waters2695高壓液相色譜儀,美國Waters公司;紫外投射反射分析儀,北京新技術應用研究所。薄層色譜硅膠GF254,青島海洋化工有限公司;MCI-GELCHP-20P填料,日本三菱公司。磷酸、正己烷、氯仿、二氯甲烷、無水甲醇、乙酸,分析純,上海振興化工一廠;二乙胺,分析純,天津市大茂化學試劑廠。1.2農村地區(qū)農村重、堿法分離的產物以硫酸長春堿為原料,在威爾斯邁爾試劑作用下,經過脫水反應得到脫水長春堿,再將脫水長春堿進行溴代反應,然后縮環(huán)得到含長春瑞濱的反應液,減壓蒸去有機溶劑,得到長春瑞濱粗品。1.3溶劑體系的選擇選擇展開溶劑系統(tǒng):二氯甲烷、甲醇、正己烷、水(少許二乙胺或者乙酸調節(jié)pH)。調節(jié)各組分中的濃度,并在薄層色譜硅膠薄板(TLC)上對合成的瑞濱反應液進行展開實驗,紫外顯色,選擇出具有最佳展開效果的溶劑體系。正相干柱柱色譜分離:取適量硅膠GF254粉末,活度保持在Ⅱ～Ⅲ級。常壓、干法裝入Φ1.5cm的柱狀PVC塑料膜中,制成1.5cm×15cm的干柱。稱取90mg長春瑞濱粗品,用0.5mL甲醇溶解,加入干柱的頂端,在常壓條件下,采用選擇好的溶劑體系自上而下進行展層,直到溶劑展至柱底,停止展層。將展好的硅膠干柱均分成4段刮出,然后氯仿浸泡振蕩,砂芯漏斗抽濾,減壓濃縮,TLC與高壓液相(HPLC)跟蹤檢測,與標樣對照品對比,合并含長春瑞濱的部分,得到中度分離的長春瑞濱。1.4洗脫溶劑和流動相的篩選反相柱色譜是本工藝的關鍵步驟。采用內徑1.0cm的自制層析柱,操作過程如下:MCI-GELCHP-20P用甲醇充分浸泡,脫氣后,用濕法裝柱。每克經干柱純化過的瑞濱粗品,用10mL洗脫劑溶解后上柱,再用不同比例的洗脫劑(主要是指甲醇、乙腈、水的組成和成分的比例)進行洗脫,用蠕動泵輸送洗脫劑,流速約為0.2mL/min,分部收集器分段收集流出液,用TLC定性,合并含長春瑞濱的部分,減壓濃縮至干,稱量后用甲醇溶解,經HPLC定量分析。流動相的選擇及優(yōu)化:床層高度15cm(床層體積11.8mL),填料負載量10mg/g,采用不同的洗脫劑(主要是指甲醇、乙腈、水的組成和成分的比例)進行洗脫,得到流動相組成對柱色譜分離過程的影響。負載量的優(yōu)化:在床層高度15cm(床層體積11.8mL)、不同負載量情況下,采用V(甲醇)∶V(水)=80∶20洗脫劑進行洗脫,得到負載量組成對柱色譜分離過程的影響。1.5lc-ms/ms檢測條件采用紅外(IR)、核磁共振(NMR)確認樣品的結構。長春瑞濱的含量參照文獻用高效液相色譜測定。HPLC檢測條件:色譜柱為C18柱(Φ4.6mm×250mm,5μm,AmershamBiosciences),柱溫為28℃,流動相V(二乙胺)∶V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=3∶165∶280∶152(磷酸調pH至6.8),流速1mL/min,檢測波長267nm,進樣量10μL。2結果與討論2.1分離體系的篩選在硅膠GF254的薄層實驗中,發(fā)現(xiàn)4個溶劑系統(tǒng)能使長春瑞濱的Rf值在0.3～0.8之間,它們分別是:①純甲醇;②V(甲醇)∶V(正己烷)=95∶5;③V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=95∶5;④V(甲醇)∶V(正己烷)∶V(水)=49∶49∶2。長春瑞濱粗品在上述4個展開體系中的TLC結果如表1所示。綜合比較后選取V(甲醇)∶V(正己烷)=95∶5體系作為干柱色譜的展開劑。以體系②為展開劑,對合成后的粗品進行干柱硅膠分離,將干柱硅膠從上到下均分為4段,用氯仿充分萃取后,用HPLC法定量檢測每段長春瑞濱的含量。結果顯示,長春瑞濱幾乎全部分布在干柱的第2和第3段硅膠里面,雜質主要分布在第1和第4段硅膠里面。第2段和第3段純度大于71.4%和78.3%,與分離前的純度(34.7%)相比,長春瑞濱純度明顯提高。合并第2、第3段蒸干后的殘留物,稱量,計算得干柱色譜回收率為65.9%。2.2抗真浮相mci-gelchp-20柱層析成像2.2.1流動相中甲醇含量對洗脫劑回收率的影響使用MCI-GELCHP-20填料對長春瑞濱粗品進行預實驗表明,甲醇/水體系可作為良好的洗脫劑體系,進一步對該體系進行優(yōu)化。表2顯示,隨著流動相中甲醇含量的增加,產品純度和洗脫體積顯著下降,產品回收率略有增加。當V(甲醇)∶V(水)=80∶20時,既能保證一次性過柱產品純度大于96.0%,又能達到使用較少洗脫液的目的(約為4.2個床層體積)。2.2.2不同率的率差異從表3可見,隨著進料量的增加,產品純度下降,而回收率差異不大,且都很高。如果要求通過一次柱層析達到純度96.0%以上的產品,不能有很高的負載量(指每克填料負載的樣品質量),合適的負載量為10mg/g。2.3后農村地區(qū)的含量HPLC分析結果顯示,經MCI-GELCHP-20P柱純化后長春瑞濱的含量達到96%。再經過V(甲醇)∶V(水)=90∶10溶劑體系緩慢結晶,晶體過濾、洗滌,HPLC分析結果表明了純度達98%以上,其IR、NMR、MS譜數(shù)據(jù)與進口標準樣品一致。3長春堿衍生物雜質分離在探尋硅膠TLC展開劑條件時,筆者觀察到,使用脫水和未經脫水處理的甲醇,獲得的長春瑞濱與主要雜質斑點的Rf比值(含一定水分)并不相同,后者比前者對長春瑞濱的洗脫能力更強,說明微量的水分存在下有利于長春瑞濱與雜質的分離。相應地,當干柱分離粗樣品時,使用未經活化處理的硅膠比經105℃活化處理1h的硅膠對長春瑞濱與雜質的分離效果稍好(結果未列出)。另外,不論是硅膠色譜還是在MCI-GELCHP-20柱或者C18柱(HPLC分離)上,長春瑞濱的保留值都較其他物質大。這些都提示,對長春瑞濱和其結構類似的伴生雜質分離,更適合利用“反相分離”模式。以硫酸長春堿為原料,經過脫水、溴代、縮環(huán)等步驟得長春瑞濱的反應過程中,長春堿雙吲哚環(huán)上面的活性基團容易發(fā)生氧化水解等反應,主要生成以下幾種長春堿衍生物雜質:一是長春堿雙吲哚環(huán)上面的3個甲酯鍵極易發(fā)生水解,生成如4-O-deacetylvinorelbine(相對分子質量為737)等去乙酰基長春瑞濱;二是6′位的N原子發(fā)生氧化,生成氮氧化合物vinorelbin6′-oxide(6′-氧化長春瑞濱,相對分子質量為795);三是20′位的C原子發(fā)生氧化,形成20′-hydroxyvinorelbine(20′-羥基長春瑞濱,相對分子質量為795)。這幾種雜質結構與長春瑞濱極其相似,分子質量相近,所以用一般的填料很難將這些雜質與長春瑞濱高效率分離。另一方面,由于吲哚環(huán)上的酯鍵被水解為羥基,氮原子上形成了新的N—O鍵,這些雜質的極性都略大于長春瑞濱。從理論上講,采用聚苯乙烯系列反相色譜系統(tǒng),應該能得到較好的分離效果,本實驗良好的分離結果證實了這一推測。干柱柱色譜能省時省工,節(jié)約溶劑,利用它先將有機合成中的大部分極性較大的雜質除去,可以降低后續(xù)分離對精細填料的損害,從而降低分離成本。在目前實際工業(yè)生產中,已經發(fā)明了一種組合式色譜干柱裝置,解決了目前色譜