激活LXR對海馬神經(jīng)元神經(jīng)甾體合成的促進作用

激活LXR對海馬神經(jīng)元神經(jīng)甾體合成的促進作用【摘要】目的：研究肝X受體激活對海馬神經(jīng)元神經(jīng)甾體合成的影響.方法：將大鼠海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)至第7日，在培養(yǎng)液中加入μmol/LTO901317，繼續(xù)培養(yǎng)48h.應用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用分離測定培養(yǎng)液中游離型神經(jīng)甾體孕烯醇酮、脫氫表雄酮和結(jié)合型神經(jīng)甾體孕烯醇酮硫酸酯、脫氫表雄酮硫酸酯的含量；RTPCR方法觀察海馬神經(jīng)元P450側(cè)鏈裂解酶、甾體合成快速調(diào)節(jié)蛋白和3β羥基甾醇脫氫酶等神經(jīng)甾體合成關鍵酶基因的mRNA的表達.結(jié)果：TO901317激活LXR，促進P450scc，StAR和3βHSD的mRNA表達，增加海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液中神經(jīng)甾體PREG，DHEA，PREGS和DHEAS含量.結(jié)論：LXR激活時，可通過上調(diào)海馬神經(jīng)元P450scc，StAR和3βHSD的mRNA表達，促進神經(jīng)甾體的合成.

【關鍵詞】肝X受體；P450側(cè)鏈裂解酶；神經(jīng)甾體；海馬,神經(jīng)元

【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectofliverXreceptor(LXR)activationonthesynthesisofneurosteriodinhippocampalneurons.METHODS:Onday7ofculture,hippocampalneuronsweretreatedwithμmol/LTO901317dissolvedindimethylsulfoxidefor48h.ThemRNAexpressionsofP450sidechaincleavage(P450scc),steroidogenicacuteregulatoryprotein(StAR)and3βhydroxysteroiddehydrogenase(3βHSD)weremeasuredbyRTPCRandthecontentsofunconjugatedneurosteriodspregnenolone(PREG),dehydroepiandrosterone(DHEA)andconjugatedneurosteroidspregnenolonesulfate(PREGS),dehydroepiandrosteronesulfate(DHEAS)inmediumwereanalyzedanddeterminedusinghighperformanceliquidchromatographymassspectrometry(HPLCMS).RESULTS:IncubationofhippocampalneuronswithTO901317significantlyincreasedtheexpressionsofP450scc,StARand3βHSDmRNAandthelevelsofPREG,DHEA,PREGSandDHEAS.CONCLUSION:ActivationofLXRcontributestothesynthesisofneurosteriodbyupregulatingtheexpressionsofP450scc,StARand3βHSDinhippocampalneurons.

【Keywords】liverXreceptor;P450sidechaincleavageenzyme;neurosteroid;hippocampus;neurons

0引言

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽固醇在甾體合成快速調(diào)節(jié)蛋白的引導下被轉(zhuǎn)運到線粒體內(nèi)膜，然后由P450側(cè)鏈裂解酶催化生成孕烯醇酮，后者在3β羥基甾醇脫氫酶等的催化下轉(zhuǎn)化成脫氫表雄酮，PREG和DHEA在磺基轉(zhuǎn)移酶的催化下生成結(jié)合型神經(jīng)甾體孕烯醇酮硫酸酯和脫氫表雄酮硫酸酯，發(fā)揮生物效應.體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元和小鼠阿爾茨海默病模型均表明，用人工合成配體TO901317激活肝X受體能增加其下游基因ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1的表達，阻止AD發(fā)生［1-2］.本實驗旨在觀察LXR激活時對海馬神經(jīng)元神經(jīng)甾體的合成和分泌有何影響.

1材料和方法

材料

DMEM、優(yōu)級胎牛血清；L左旋多聚賴氨酸、阿糖胞苷、二甲基亞砜、TO901317；胰蛋白酶；Trizol；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；pfuDNA聚合酶；Agilent液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀［HP1100自動進樣器、大氣壓化學離子源(APCI)及四極桿質(zhì)譜檢測器］；神經(jīng)甾體標準品.

方法

海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)及處理采用文獻［3］的方法，并稍加以改動.取當日新生Wastar大鼠，750mL/L乙醇消毒，取出完整腦組織置于DMEM中，鈍性分離海馬并去除血管和腦膜，將海馬剪成1mm×1mm×1mm小塊，g/L胰蛋白酶，37℃消化25min.等體積種植液即含100mL/L胎牛血清和1×105U/L青、鏈霉素的DMEM終止消化5min并洗滌1次.用Pasteur吸管輕柔吹打25次左右獲得單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×108/L，接種于預先L多聚賴氨酸處理過的35mm培養(yǎng)皿中.置37℃，50mL/LCO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng).培養(yǎng)至第3日改用含300μg/L阿糖胞苷的飼養(yǎng)液，作用24h后去除.培養(yǎng)至第7日，將所有神經(jīng)元隨機分為2組，每組6孔：處理組換含μmol/LTO901317的飼養(yǎng)液，對照組換含等體積DMSO的神經(jīng)元飼養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h.

海馬神經(jīng)元總RNA提取、RTPCR細胞用預冷的PBS輕漂2遍，Trizol法提取總RNA.RT及PCR參照試劑盒說明，PCR引物由上海生工生物工程技術有限公司.各待測基因退火溫度、擴增產(chǎn)物長度見表1.取內(nèi)參照βactin和待測基因PCR產(chǎn)物5μL，20g/L瓊脂糖凝膠電泳.凝膠成像分析系統(tǒng)分析待測基因與βactinPCR產(chǎn)物的光密度比值.表1各基因的PCR引物序列、退火溫度和產(chǎn)物長度基因

細胞培養(yǎng)液中神經(jīng)甾體的提取和純化采用本實驗室固定方法［4］.

統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)均用x±s表示.應用SPSS軟件進行成組設計的t檢驗，P＜有統(tǒng)計學意義.

2結(jié)果

激活對海馬神經(jīng)元ABCA1mRNA表達的影響與對照組相比，處理組海馬神經(jīng)元ABCA1mRNA表達升高，兩組差異有統(tǒng)計學意義［和，t=-，P＜）］.

激活對海馬神經(jīng)元神經(jīng)甾體合成關鍵酶P450scc、StAR和3βHSDmRNA表達的影響與對照組相比，處理組P450scc，StAR和3βHSD的mRNA表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義.表2LXR激活對大鼠海馬神經(jīng)元P450scc，StAR和3βHSDmRNA表達的影響

激活對海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液神經(jīng)甾體含量的影響與對照組相比，處理組PREG，DHEA和PREGS，DHEAS的含量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義

3討論

AD是一種神經(jīng)退行性病變，特征性病理改變?yōu)棣碌矸蹣与脑诩毎獬练e形成老年斑，海馬是Aβ最早出現(xiàn)和病變最嚴重的主要腦區(qū).Aβ具有神經(jīng)毒性，所致的膽堿能系統(tǒng)損傷是AD認知功能障礙的重要決定因素.神經(jīng)甾體具有廣泛的生物學作用，參與神經(jīng)元的發(fā)育分化、突觸的可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、學習與記憶等.WeillEngerer等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，AD患者各腦區(qū)的神經(jīng)甾體水平均較正常人降低，且皮質(zhì)結(jié)合型神經(jīng)甾體PREGS和DHEAS含量與Aβ含量呈負相關，提示神經(jīng)甾體水平降低在AD的發(fā)生中起重要作用.在本實驗中，我們檢測到LXR激活后ABCA1mRNA表達的上調(diào)，證實在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元TO901317能與LXR結(jié)合，并進一步激活其下游基因.我們還發(fā)現(xiàn)，LXR激活后，海馬神經(jīng)元神經(jīng)甾體合成的關鍵酶P450scc，StAR和3βHSD的mRNA表達增加，游離型和結(jié)合型神經(jīng)甾體的合成增多，說明LXR激活，上調(diào)海馬神經(jīng)元神經(jīng)甾體合成關鍵酶P450scc，StAR和3βHSD的mRNA表達，促進海馬神經(jīng)元神經(jīng)甾體的合成和分泌.

大鼠海馬神經(jīng)元有P450scc，StAR和3βHSD等神經(jīng)甾體合成酶的表達，能以區(qū)域特異性的方式合成各種神經(jīng)甾體.其中結(jié)合型神經(jīng)甾體PREGS和DHEAS是興奮性神經(jīng)甾體，能增強神經(jīng)元的興奮性和突觸可塑性，促進動物的記憶獲得和保持.PREGS是一種有效的記憶增進劑，能促進乙酰膽堿遞質(zhì)的釋放，增強空間記憶，在老年大鼠海馬中PREGS濃度的下降與學習記憶功能的喪失呈正相關［6］，而DHEAS是雄激素和雌激素的前體，可增強老年大鼠的學習和記憶，延緩腦衰老［7］.我們的研究首次表明，LXR激活時，除了上調(diào)ABCA1mRNA表達，促進細胞內(nèi)膽固醇外流，降低海馬神經(jīng)元Aβ產(chǎn)生外，還通過上調(diào)P450scc，StAR和3βHSDmRNA的表達來增加神經(jīng)甾體的合成和分泌，從而增強學習能力，減緩記憶衰退，改善AD早期的認知功能障礙.

【參考文獻】

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