干擾素靶向修飾的研究進(jìn)展

干擾素靶向修飾的研究進(jìn)展

干預(yù)是糖蛋白。這是一個(gè)重要的家庭細(xì)胞。它具有光譜效應(yīng)、抗細(xì)胞復(fù)制和免疫調(diào)節(jié)。根據(jù)人類(lèi)干擾素產(chǎn)生的來(lái)源和結(jié)構(gòu)不同可分為α干擾素、β干擾素和γ干擾素3類(lèi)。其中抗病毒活力最高的IFN-α又分為I型和II型,至少有23個(gè)不同變種,這些蛋白的分子量為19～26kDa,由156～166或172個(gè)氨基酸組成。IFN-α為第一個(gè)廣泛應(yīng)用于臨床并取得明顯療效的細(xì)胞因子,已被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于病毒性肝炎、癌癥及多發(fā)性硬化癥等疾病。但干擾素相對(duì)分子量較小,易被腎小球?yàn)V過(guò),易被血清蛋白酶降解,半衰期短需一周3次頻繁給藥,副作用較大等缺點(diǎn)導(dǎo)致患者依從性低。因此,改善IFN-α代謝動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)特征的研究正在廣泛進(jìn)行。隨著基因工程的發(fā)展,改善IFN-α特征的主要技術(shù)手段有聚乙二醇修飾,糖基化修飾,白蛋白修飾,lgGFc片段修飾,靶向修飾等。本文對(duì)其最新研究進(jìn)展作一概述。1peg與ifn分子偶聯(lián)修飾聚乙二醇(PEG)修飾又稱(chēng)PEG化(PEGylation),是20世紀(jì)70年代后期發(fā)展起來(lái)的修飾方法。將PEG與IFN分子偶聯(lián),修飾后產(chǎn)物分子量增加使腎小球?yàn)V過(guò)率下降;位阻效應(yīng)使其抵抗蛋白酶水解能力提高、抗原決定簇被遮擋、免疫原性下降;半衰期延長(zhǎng)、血漿清除率降低等。但PEG阻礙了IFN與受體結(jié)合,活性常會(huì)大幅下降。目前PEG修飾技術(shù)已較成熟,隨著分子構(gòu)建技術(shù)的發(fā)展,非定點(diǎn)修飾逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎c(diǎn)修飾。1.1peg-ifn的活性美國(guó)先靈葆雅公司早在2000年推出世界上第一個(gè)長(zhǎng)效干擾素:12KDPEG-IFN-α2b佩樂(lè)能(PegIntron),獲得了歐洲及美國(guó)藥監(jiān)局批準(zhǔn)。它是由E.Coli生產(chǎn),使用甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(NHS-mPEG)修飾IFN的His殘基和Lys殘基,NHS-mPEG和His成鍵不穩(wěn)定,在體內(nèi)會(huì)斷裂釋放IFN-α2b起到緩釋作用。2002年,瑞士羅氏公司使用40KD的分支化(含兩條PEG鏈)NHS-mPEG與IFN-α2a的11個(gè)Lys殘基分別反應(yīng),得到了含穩(wěn)定酰胺鍵的PEG-IFN-α2a派羅欣(Pegasys)并獲得了FDA批準(zhǔn)。靜脈注射后,佩樂(lè)能半衰期是40h,為未修飾IFN的10倍,活性保留為原來(lái)的28%。派羅欣半衰期是80h,保留1%活性。選擇大小、形狀合適的修飾劑是PEG修飾技術(shù)的關(guān)鍵。續(xù)雙分支化PEG被羅氏使用后,Jo等使用一種43kDa三聯(lián)體PEG修飾IFN-α2a,單修飾PEG3-IFN-α2a體外活性為10%,優(yōu)于派羅欣,小鼠體內(nèi)半衰期為未修飾IFN的40倍。1.2peg修飾后活性成分變化鑒于IFN中PEG非定點(diǎn)修飾位點(diǎn)咪唑基、氨基數(shù)量多,有時(shí)甚至達(dá)數(shù)10個(gè),最終產(chǎn)品常含異構(gòu)體和多修飾體,給純化和質(zhì)控步驟帶來(lái)很多麻煩。通過(guò)定點(diǎn)突變引入游離半胱氨酸,再進(jìn)行PEG定點(diǎn)修飾,可提高生產(chǎn)的可控性。2008年,Bell等將IFN-α2的111位Met突變?yōu)镃ys得到IFN-M111C,以20kDa和40kDa的PEG修飾后,分別保留了原蛋白活性的1/2和1/3,延長(zhǎng)半衰期26倍和38倍;與佩樂(lè)能體外活性區(qū)別不大,卻是40kDa的PEG非定點(diǎn)修飾的派羅欣體外活性的7～10倍。同時(shí)20kDaPEG-IFN-M111C在裸鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中有明顯療效。這一進(jìn)展打破了以往共識(shí),證明了IFN-α2在某些不重要位點(diǎn)突變并經(jīng)PEG修飾,生物活性仍可以在很大程度上得以保留。北京三元基因牛曉霞等使用高生物活性重組集成干擾素IFN-Con和黃種人特有低副作用IFN-α1b的分子序列作為模板,利用DNAShuffling技術(shù)進(jìn)行分子重組和篩選,獲得了高效低毒的IFN-Con-m1,然后將其86位Tyr突變?yōu)镃ys,得到可供定點(diǎn)修飾的IFN-Con-m2,再用20kDa的PEG-MAL進(jìn)行修飾,得純度高于98%的PEG-IFN-Con-m2,保留了未被修飾時(shí)體外活性的1%,半衰期18h,穩(wěn)定性經(jīng)抗胰蛋白酶水解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證增強(qiáng)顯著。2小鼠糖基化的結(jié)構(gòu)及修飾蛋白質(zhì)表面糖鏈能夠影響蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、生物活性和穩(wěn)定性等,糖基化同時(shí)也為某些蛋白質(zhì)發(fā)揮生物活性所必需。添加的糖鏈一方面增大了IFN的分子量及空間體積,減少了腎小球的濾過(guò)效應(yīng);一方面由于富含唾液酸提高了電荷相應(yīng)減少了腎消除作用;另外由于與受體親和力減小,在很大程度上也避免了受體介導(dǎo)的清除作用。糖基化干擾素目前仍處于臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,但已有多份研究報(bào)告展示了其良好前景。2008年,Dissing-Olesen等以小鼠經(jīng)IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白MX蛋白的mRNA量作為觀(guān)測(cè)指標(biāo)對(duì)IFN-β1aN端糖基化相關(guān)理論做了系統(tǒng)的研究,證明糖基化的糖鏈結(jié)構(gòu)尤其是糖鏈末端的唾液酸殘基對(duì)于穩(wěn)定和增溶IFN有著明顯的作用。Ceaglio等近幾年針對(duì)IFN-α的N端糖基化進(jìn)行了深入研究。通過(guò)點(diǎn)突變,向重組hIFN-α2b序列中插入4個(gè)N端糖基化保守序列,構(gòu)造潛在N端糖基化位點(diǎn)Asn-X-Ser/Thr(X可以是除脯氨酸以外任意氨基酸)。IFN通過(guò)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá),N端可自行完成糖基化修飾,得到4N糖基化干擾素(4N-IFN)。遠(yuǎn)紫外圓二色譜(CD)證明,IFN結(jié)構(gòu)未因糖基化影響而發(fā)生改變。4N-IFN保留了未修飾IFN體外活性的10%,半衰期延長(zhǎng)了25倍,較佩樂(lè)能半衰期更長(zhǎng);小鼠靜脈注射后線(xiàn)下面積增長(zhǎng)10倍,體內(nèi)分布也更廣泛,并有顯著的體內(nèi)抗腫瘤活性。4N-IFN對(duì)血清蛋白酶、酸性pH、熱、反復(fù)凍融的穩(wěn)定性較未修飾IFN均有所提高,溶解度和熔點(diǎn)更有明顯提高。MALDI-TOFMS和HPAEC-PAD的糖檢測(cè)結(jié)果顯示,4N-IFN有大量的四聯(lián)和三聯(lián)N-糖鏈結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)使其具有了優(yōu)良特性。3新分子與蛋白利用基因融合技術(shù)可以將IFN與特定蛋白共表達(dá),新分子兼有兩者特點(diǎn)。目前常用的IFN修飾蛋白有人血清白蛋白和抗體Fc片段,均用于改善藥物半衰期。3.1治療ifn-2m的活性人血清白蛋白(HSA)是人血清中含量最高的物質(zhì)輸送載體,分子量約為65KDa,是585個(gè)氨基酸組成的單鏈球型蛋白質(zhì)。HSA無(wú)酶學(xué)及免疫學(xué)活性,體內(nèi)半衰期長(zhǎng)達(dá)19d。目前,由人類(lèi)基因科技公司和諾華公司合作開(kāi)發(fā)的人血清白蛋白融合干擾素——ZALBIN(albinterferonalfa-2b,又名Albuferon?)已上市,主要用于治療丙型肝炎,分子結(jié)構(gòu)模型如圖1所示。它由酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá),為HSA的C端與IFN-α2b的N端直接融合形成的單鏈蛋白質(zhì)分子,分子量為85.7KDa。臨床試驗(yàn)表明,其平均清除半衰期為159h,有效性和安全性與佩樂(lè)能相當(dāng)。我國(guó)科學(xué)家Huang等通過(guò)連接肽將HSA的C端與IFN-α2b的N端連接,由畢赤酵母分泌表達(dá)得到純度大于97%的HSA-IFN-α2b。測(cè)定其體外活性為未融合IFN-α2b活性的1.4%。食蟹猴皮下注射后,與IFN療效正相關(guān)的2′,5′-OAS表達(dá)顯著增加;其在體內(nèi)活性可維持14d,較IFN-α2b有明顯提高。Zhao等發(fā)現(xiàn)HSA-IFN-α2b易形成二聚體,導(dǎo)致產(chǎn)物復(fù)性率僅為10%,且產(chǎn)物需制成凍干粉保存。位點(diǎn)突變研究證明,HAS可能影響了IFN-α2b的Cys1和Cys98二硫鍵的穩(wěn)定性。改變?nèi)诤系鞍字袃煞肿拥逆溄禹樞驅(qū)FN-α2b的C端與HSA的N端基因相連,得IFN-α2b-HSA。其復(fù)性率為25%,半衰期為50h,37℃溶液條件下可長(zhǎng)時(shí)間保持良好的均一性和穩(wěn)定性。但經(jīng)加速力學(xué)和熱效應(yīng)進(jìn)一步測(cè)試發(fā)現(xiàn),IFN-α2b-HSA傾向通過(guò)錯(cuò)誤的二硫鍵形成聚合物,而聚合物會(huì)增加藥物的免疫原性。通過(guò)點(diǎn)突變將非對(duì)稱(chēng)Cys替換為Ser,構(gòu)建IFN-α2b-HSA(C345)。實(shí)驗(yàn)表明,C345和IFN-α2b-HAS擁有相似的藥代動(dòng)力學(xué)行為。通過(guò)72h的加速攪拌實(shí)驗(yàn)、60℃的2h孵育之后,有超過(guò)90%的C345仍保持著單體結(jié)構(gòu)。其復(fù)性率和穩(wěn)定性的提高使得制備HSA融合IFN制劑成為可能。3.2融合不同亞型fc的fn-2m基因檢測(cè)人IgG免疫球蛋白是人體的主要抗體,因其Fc片段可與新生Fc受體結(jié)合,避免IgG進(jìn)入溶酶體中被降解,半衰期可長(zhǎng)達(dá)20d。王磊等構(gòu)建了IFN-α2b與人lgG不同亞型Fcγ片段的融合基因,在畢赤酵母中以二聚體形式分泌表達(dá),并有部分糖基化。經(jīng)體外活性檢測(cè),融合不同亞型Fcγ的FN-α2b抗病毒活性均有所降低,其中IFN-α2b-Fcγ2受影響最小,只降低了2.3倍。大鼠皮下注射后半衰期達(dá)65h,約是商品重組干擾素的9倍。4其他修飾修飾IFN治療病毒性乙型肝炎時(shí),并不能取得理想治療效果的原因可能是藥物在肝炎病毒主要復(fù)制部位——肝臟中分布較少。所以近年來(lái)IFN的另一主要研究方向?yàn)榘邢蛐揎?通過(guò)將IFN與具有特殊親和力的載體相連,直接將IFN運(yùn)送到靶器官,以期擁有少量高效低毒的特性。另外,IFN-β和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)均為有效抗癌藥物,以腺相關(guān)病毒(AAV)為載體,構(gòu)建聯(lián)合重組病毒也是靶向治療腫瘤的有效手段。4.1半乳糖基化法去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoproteinreceptor,ASGP-R)又名肝凝集素(liverlectin),僅存在于哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞膜,能專(zhuān)一性結(jié)合末端帶有半乳糖殘基的糖蛋白并定向轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)。早在1996年,鐘裕國(guó)等就利用2-亞胺基-2-甲氧乙基-1-硫代半乳糖苷與蛋白質(zhì)一級(jí)氨基偶聯(lián),將2～3個(gè)半乳糖殘基引入IFN-α1分子上,制備了半乳糖基α1-干擾素(IFN-α1-Gal),核素示蹤法結(jié)果顯示IFN-α1-Gal較未修飾IFN-α1具有明顯趨肝性,且效價(jià)提升了2.77倍。但I(xiàn)FN-α上僅含有10個(gè)Lys,可用于糖基化的更少,采用這種糖基化方法,一般只能連2～3個(gè)半乳糖分子,使IFN的靶向性受到了限制。近年,采用半乳糖化血清白蛋白(含有69個(gè)Lys)為載體,有效解決了這一問(wèn)題。與雙功能試劑2-亞胺基-2-乙氧基-1-半乳吡喃糖苷共價(jià)連接,Cai等得到了偶合物G-HSA-IFN,該分子上連有大約24個(gè)硫代半乳糖。其抗病毒活性較HSA-IFN并未明顯增加,但體內(nèi)分布研究表明,G-HSA-IFN具有顯著趨肝性(>45%/g),加之具有HSA-IFN的長(zhǎng)效性特點(diǎn),臨床前景良好。4.2fv抗體靶向基因缺失菌株二硫鍵穩(wěn)定性Fv抗體(disufide-stabilizedFvfragments,dsFv)是近年發(fā)展起來(lái)的新型基因工程抗體,具有分子小,穩(wěn)定性好,生物活性高等特點(diǎn)。宋宏彬等通過(guò)篩選噬菌體抗體庫(kù)得到人源抗HBsAg基因工程抗體,采用定點(diǎn)突變獲得二硫鍵穩(wěn)定性Fv抗體,將其輕鏈基因與IFN融合后,與重鏈基因分別構(gòu)建真核表達(dá)載體,共同轉(zhuǎn)染CHO后,得到了兼有抗HbsAg活性和IFN活性的融合蛋白。2010年,江樂(lè)等在此基礎(chǔ)上,如圖2所示,在重鏈基因3′端融入一段帶正電荷的DNA負(fù)載區(qū)(與這一段基因融合表達(dá),將使目的蛋白帶正電荷,能結(jié)合帶負(fù)電的質(zhì)粒DNA),再將dsFv抗體的輕鏈和重鏈兩部分基因通過(guò)自身切割肽F2A連接置于同一開(kāi)放讀碼框,克隆入高效真核表達(dá)載體pEE14·1,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pEE14·1-dsFvαpr+并在CHO中表達(dá)。后續(xù)計(jì)劃與帶負(fù)電荷的HBV治療性DNA疫苗通過(guò)靜電作用耦合,制備抗體靶向納米顆粒?？刂葡聵?gòu)建成腫瘤靶向病毒即AAV-hTERT-IFN-β-TRAIL聯(lián)合病毒。對(duì)比單一治療對(duì)A549肺癌細(xì)胞的體內(nèi)外生長(zhǎng)抑制情況,聯(lián)合病毒可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞毒性和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng),療效更好。這一研究提供了新的腫瘤靶向雙基因治療策略。5修飾產(chǎn)物的治療IFN抗腫瘤抗病毒為醫(yī)學(xué)界公認(rèn),而最新基因工程修飾手段對(duì)于IFN更廣泛的應(yīng)用有重要意義。文中所提到改善IFN特征的主要技術(shù)手段及其修飾后產(chǎn)品如表1所示。修飾后常見(jiàn)問(wèn)題為體外活性下降,這通常是蛋白活性位點(diǎn)被修飾劑阻擋導(dǎo)致的,可通過(guò)修飾產(chǎn)物半衰期的延長(zhǎng)和增大給藥量