原蟲檢驗(yàn)技術(shù)2010培訓(xùn)(陜西)

瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)中國CDC寄生蟲病所瘧疾室鄭香

瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)●采集血樣●血片的制作與染色●原蟲鏡檢

1.白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法2.原蟲形態(tài)鑒定采集血樣采血部位：耳垂或無名指，取血方法：通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小,薄血膜血量為厚血膜的一半或1/3。厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。寡闻c平置的載玻片接觸，再由里向外一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜薄血膜再取一小滴血.將血置于第一張玻片離厚血膜適當(dāng)遠(yuǎn)的地方.將推片的邊緣緊貼載玻片，輕輕上下移動(dòng)，使血液沿邊緣散開，然后勻速地向前推進(jìn)，形成薄而平鋪的薄血膜血片制作厚血膜薄血膜標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片標(biāo)簽●厚血膜血量不宜過多或過少●薄血膜平整,無皺折和空泡.顯微鏡下紅細(xì)胞單層排列各種不同的瘧疾血片涂制法：標(biāo)準(zhǔn)血片門診發(fā)熱病人血片居民普查血片血片染色

兩種染色方法:●吉氏染色法●瑞氏染色法

WHO推薦使用吉氏染色法吉氏染液(原液)的配置

吉氏染粉(AzureBtype)5g甘油(純)250ml甲醇

(純)250ml●吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨,

然后邊加邊磨，直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在研缽中加入少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復(fù)數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置于室內(nèi)，每天晃動(dòng)數(shù)分鐘，存放一周后經(jīng)過濾即可使用。保存時(shí)間越長染色效果越好。●整個(gè)染色液配制時(shí)間不能少于5個(gè)小時(shí)稀釋吉氏原液●原液需經(jīng)緩沖液（PH7.0）或凈水稀釋后，方可用于厚薄血片染色。

●吸取原液時(shí)，不要晃動(dòng)瓶子,以免沉淀物泛起影響染色效果.血片染色用甲醇固定薄血膜，待厚血膜充分干燥（要點(diǎn)：甲醇不能觸碰到厚血膜）操作1（快染）

量筒內(nèi)量2ml緩沖液(PBSPH7.0)或凈水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標(biāo)本的厚薄血膜上，染色10min，清水緩緩沖洗，晾干（血膜朝內(nèi)面）鏡檢。操作2(慢染)在量筒內(nèi)量2ml緩沖液或凈水，再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標(biāo)本上，染色30min。清水緩緩沖洗，晾干鏡檢。血片染色將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液（3毫升吉氏原液加緩沖液或凈水97毫升，混勻）浸沒血片，同時(shí)對厚薄血膜染色30分鐘。（如染液稀釋液不合標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，得酌情增減染色時(shí)間和濃度），然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將染色片插于晾干板上晾干，包裝，待鏡檢。成批血片染色厚血膜溶血染色放置多時(shí)未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固定），在染色之前，須在厚血膜上用清水進(jìn)行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液染色30分鐘。然后用清水漂洗干凈,晾干。質(zhì)量好的染色

顯微鏡下核呈紅色,胞漿呈藍(lán)色，薄血膜平整，紅細(xì)胞單層排列

如果血片偏紅,說明染液偏酸性如果血片偏藍(lán),說明染液偏鹼性外觀吉氏染色血片偏酸偏堿標(biāo)準(zhǔn)血片制作與染色注意事項(xiàng)

●

載玻片必須清潔無油污●

固定薄血膜時(shí)，甲醇不要觸碰到厚血膜●

放置3天以上的血片，在染色之前先用清水滴加在厚血膜上進(jìn)行溶血，以防厚血膜染色后顏色發(fā)黑，影響鏡檢.●血片充分干燥后方可染色，防止沖洗染液時(shí)厚血膜脫落.瘧原蟲鏡檢瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)

厚血膜

薄血膜

優(yōu)點(diǎn)血量多，面積小，一個(gè)厚血膜的血量相當(dāng)于20張薄血片。原蟲檢出率高經(jīng)甲醇固定，紅細(xì)胞完整，原蟲形態(tài)改變不大，原蟲易于辨認(rèn)缺點(diǎn)原蟲在干燥過程中皺縮，紅細(xì)胞消失，原蟲變形較大，原蟲鑒定困難血量比厚血膜少許多，但面積是厚血膜的8-10倍。檢查費(fèi)時(shí)，原蟲檢出率較低用途用于瘧疾病人檢查原蟲蟲種、蟲期鑒定及初學(xué)者教學(xué)標(biāo)本瘧原蟲密度計(jì)算計(jì)算瘧原蟲密度的三種方法：●

白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法(厚血膜WHO)

優(yōu)點(diǎn)：可作為定性和定量分析●半定量計(jì)數(shù)法(厚血膜)

優(yōu)點(diǎn)：方法簡便

缺點(diǎn)：只能定性，不宜作為定量分析●

紅細(xì)胞感染密度計(jì)算法(薄血膜)白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)用途●確定患者原蟲感染程度●抗瘧后考核原蟲密度●課題研究顯微鏡下厚血膜讀片順序白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)操作顯微鏡里按順序由上而下、之字形讀片×不需要計(jì)數(shù)的視野●需要進(jìn)行白細(xì)胞、瘧原蟲計(jì)數(shù)的視野如果該視野無原蟲，則計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)

■看到第一個(gè)原蟲開始計(jì)數(shù)

白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)方法●在厚血膜按視野順序，從看到第一個(gè)瘧原蟲計(jì)數(shù)開始，記錄200個(gè)白細(xì)胞中的瘧原蟲數(shù)（可分有性體和無性體），如果原蟲密度較低，可增加白細(xì)胞計(jì)數(shù)500~1000個(gè)?！癜准?xì)胞瘧原蟲計(jì)算公式：瘧原蟲數(shù)÷計(jì)數(shù)的白細(xì)胞數(shù)×患者每微升血白細(xì)胞數(shù)=瘧原蟲數(shù)/μl血?！袢绻恢颊叩陌准?xì)胞數(shù)，則每微升血以8000個(gè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(國際標(biāo)準(zhǔn))。白細(xì)胞瘧原蟲密度計(jì)數(shù)法白細(xì)胞瘧原蟲計(jì)數(shù)法舉例●假設(shè)計(jì)數(shù)200WBC中有35個(gè)瘧原蟲，在不知患者白細(xì)胞數(shù)的情況下，以每微升血8000個(gè)白細(xì)胞計(jì)數(shù),由此計(jì)算出每微升血液瘧原蟲密度為：35（計(jì)數(shù)的瘧原蟲數(shù)）÷200（計(jì)數(shù)的白細(xì)胞）x8000（每微升血白細(xì)胞數(shù)）=1400/μl答：該患者的瘧原蟲密度為1400/μl。用厚血膜每個(gè)視野中所觀察到瘧原蟲的平均數(shù)粗略地估算出瘧原蟲密度。此方法將密度分為6級：1.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個(gè)以內(nèi)，記錄實(shí)際數(shù)字2.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個(gè)以上，但平均每個(gè)視野不到1個(gè)蟲，記錄“少”3.平均每個(gè)視野1~5個(gè)蟲，記錄“＋”4.平均每個(gè)視野6~10個(gè)蟲，記錄“++”5.平均每個(gè)視野11~100個(gè)蟲，記錄“+++”6.平均每個(gè)視野100個(gè)蟲以上，記錄“++++”。

如：PvR+T++G少這種方法簡便，缺點(diǎn)是計(jì)數(shù)的瘧原蟲數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。半定量計(jì)數(shù)法如何確定瘧原蟲血片為陰性●檢查全部厚血膜視野未查見瘧原蟲●

最少檢查100個(gè)厚血膜視野未查見瘧原蟲（臨床病人）人體四種瘧原蟲的分布瘧原蟲鏡檢感染人的瘧原蟲有四種:

惡性瘧原蟲P.falciparum

間日瘧原蟲P.vivax三日瘧原蟲P.malariae

卵形瘧原蟲P.ovale

惡性瘧P.falciparum

●

分布熱帶、亞熱帶，是非洲的重要疾病●我國流行區(qū)域?yàn)樵颇鲜『秃Ｄ鲜　?/p>

四種瘧原蟲中致病力最強(qiáng)，無免疫力者感染后出現(xiàn)急性癥狀,不及時(shí)治療可危及生命（腦型瘧）間日瘧

P.vivax

●

間日瘧原蟲分布于我國大部分地區(qū),主要是中部地區(qū)●

病程良性,有復(fù)發(fā)●

遍布全球溫帶地區(qū)及大片熱帶地區(qū)。在熱帶非洲，特別是西非則很少見三日瘧

P.malariae

●遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)，特別是東、西非洲，圭亞那及印度部分地區(qū)，呈片狀、塊狀分布●三日瘧在我國非常少見，只在南方廣西有過散在報(bào)告卵形瘧（蛋形瘧）P.ovale●主要分布非洲。太平洋地區(qū)、緬甸、東南亞有散在報(bào)告●在我國已基本消滅

四種瘧原蟲形態(tài)特征

原蟲鏡檢紅細(xì)胞不漲大小滋養(yǎng)體（環(huán)狀體）纖細(xì),常有多重感染，環(huán)狀體內(nèi)可有2個(gè)核

環(huán)狀體可貼在紅細(xì)胞邊緣

血片中沒有其他發(fā)育期的大滋養(yǎng)體配子體呈新月形或臘腸形成熟裂殖體約含16-32個(gè)裂殖子可出現(xiàn)茂氏點(diǎn)惡性瘧（P.falciparum）鑒定要點(diǎn)紅細(xì)胞通常漲大薛氏點(diǎn)明顯成熟環(huán)狀體粗大滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足血片中可見各期的原蟲形態(tài)成熟裂殖體約含12-24個(gè)裂殖子

間日瘧（P.vivax）鑒定要點(diǎn)紅細(xì)胞不漲大或略小環(huán)狀體可呈方形胞漿不活躍呈帶狀形成熟滋養(yǎng)體呈菊花狀,內(nèi)含6-12個(gè)裂殖子

核可能出現(xiàn)在環(huán)狀體邊緣

三日瘧（P.malariae）診斷要點(diǎn)卵形瘧（P.ovale）診斷要點(diǎn)紅細(xì)胞正?；蚵詽q大

常見慧星狀(也稱齒輪狀)環(huán)粗大薛氏點(diǎn)明顯

成熟滋養(yǎng)體類似三日瘧原蟲但更粗大成熟裂殖體約含6-12個(gè)裂殖子

類型周圍血中發(fā)育階段紅細(xì)胞形態(tài)瘧原蟲形態(tài)大小點(diǎn)彩胞漿瘧色素裂殖子數(shù)惡性瘧原蟲環(huán)狀體配子體正常大小茂氏點(diǎn)小滋養(yǎng)體纖細(xì)，常見２個(gè)核，一個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)常有2個(gè)以上的原蟲粗黑，配子體中明顯

16-32間日瘧原蟲各期滋養(yǎng)體裂殖體配子體漲大,可達(dá)正常的1.5-2倍薛氏點(diǎn)阿米巴樣滋養(yǎng)體，淺藍(lán)色，活潑金棕色不明顯12-24

卵形瘧原蟲各期均有正常大小或略漲大,

薛氏點(diǎn)卵圓形滋養(yǎng)體，藍(lán)色較深，核較大深棕色明顯6-12三日瘧原蟲各期均有裂殖體正?；蚵钥s小齊氏點(diǎn)（西門氏）但少見圓形，藍(lán)色深，核緊縮，滋養(yǎng)體胞漿呈帶狀深棕色，粗明顯6-12

混合感染●在一個(gè)血膜上有2種以上瘧原蟲感染稱為混合感染，較常見的是間日瘧原蟲與惡性瘧原蟲混合●鏡檢判斷P.v+P.f混合感染,必須是看到P.v各期原蟲和P.f的配子體鏡檢示教以下血片采自現(xiàn)癥病例Thisisathinfilmfroma27yearoldfemalebackpacker,witharecenthistoryoftrekkingthroughNorthernThailandandhighfever.

AtypicalPlasmodiumfalciparumpresentation.●Numerousfineringforms●Doublechromatindots●Marginalforms●RedcellsarenotenlargedAthinfilmfroma22yearoldmaleholidayinginLombok(Indonesia)onemonthpreviously.Intermittentfeverssincereturning.AtypicalPlasmodiumvivaxpresenta