hplc-esims法測(cè)定人血漿中枸酸噴托維林的濃度

hplc-esims法測(cè)定人血漿中枸酸噴托維林的濃度

枸杞噴霧劑為非成毒性鎮(zhèn)咳藥，具有中心和外周性鎮(zhèn)咳作用。此外，還有少量特應(yīng)性和全身麻醉的作用，真菌病的城市咳嗽強(qiáng)度為1.3。多用于治療上呼吸道感染引起的急性、輕度咳嗽和百日咳,可減少支氣管分泌。該藥1956年由比利時(shí)聯(lián)合化學(xué)公司(UCB)開(kāi)發(fā),國(guó)內(nèi)于1962年生產(chǎn),現(xiàn)有片劑、糖漿劑、滴丸劑、復(fù)方制劑等。有關(guān)枸櫞酸噴托維林的含量分析方法,中國(guó)藥典采用非水滴定法,此外還有二階導(dǎo)數(shù)光譜法、分光光度法、示波極譜滴定法、壓電頻移法、熒光衍生法、HPLC法、離子選擇性電容法、化學(xué)發(fā)光法等,而枸櫞酸噴托維林在人血漿中的濃度測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道很少,主要是采用流動(dòng)化學(xué)發(fā)光法。該法靈敏度較高,但反應(yīng)條件比較嚴(yán)格,影響因素多,操作煩瑣,特異性及重現(xiàn)性較差,不適用于生物等效性評(píng)價(jià)所需要的大批量生物樣品的檢測(cè)操作。本文建立HPLC-ESI/MS法測(cè)定枸櫞酸噴托維林的血藥濃度,為該藥新劑型開(kāi)發(fā)中藥動(dòng)學(xué)研究及生物等效性評(píng)價(jià)提供專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的體內(nèi)藥物濃度分析方法。1固相萃取藥物美國(guó)WatersMicromassZQ4000質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(ESI)及MassLynx4.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),Waters2695型高效液相色譜儀帶自動(dòng)進(jìn)樣器;CleanertPEP固相萃取小柱,規(guī)格:30mg·mL-1,天津博納艾杰爾科技有限公司;固相萃取裝置(美國(guó)AgilentTechnologies)等。枸櫞酸噴托維林片,規(guī)格為25mg·片-1,批號(hào)0711017,天津力生制藥股份有限公司生產(chǎn)。枸櫞酸噴托維林對(duì)照品,含量101.14%,重慶巨琪諾美制藥有限公司提供。鹽酸洛拉曲克內(nèi)標(biāo),含量100.0%,南方醫(yī)科大學(xué)新藥篩選中心合成。甲醇,色譜純,Caledon公司;甲酸,色譜純,天津市化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;其余試劑為分析純。2柱溫度-甲醇條件色譜柱:InertsilODS-3C18(150mm×2.1mm,5μm);流動(dòng)相:0.1mol·L-1醋酸銨溶液(甲酸調(diào)pH至4.4)-甲醇(35∶65);流速:0.20mL·min-1;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:5μL。質(zhì)譜采用電噴霧電離源正離子模式(ESI+);離子源溫度108℃;去溶劑氣溫度380℃;毛細(xì)管電壓3kV;錐孔電壓30V;錐孔氣流量50L·h-1;去溶劑氣流量350L·h-1。選擇離子監(jiān)測(cè)(SIR),噴托維林和洛拉曲克在ESI離子化方式下,生成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+,分別為m/z334.1和m/z284.8,用于定量分析,見(jiàn)圖1。3標(biāo)準(zhǔn)血漿和內(nèi)標(biāo)溶液的制備3.1對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)定枸櫞酸噴托維林對(duì)照品98.9mg,置100mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,得濃度為1000μg·mL-1的枸櫞酸噴托維林對(duì)照品溶液①;精密量取對(duì)照品溶液①1mL置50mL量瓶中,加水稀釋至刻度,得濃度為20μg·mL-1對(duì)照品溶液②;用移液槍吸取對(duì)照品溶液②19.5,39,78,156,312,624μL及對(duì)照品溶液①25,50,150μL,分別置50mL量瓶中,并加水稀釋至刻度,得濃度分別為7.8,15.6,31.2,62.5,125,250,500,1000,3000ng·mL-1對(duì)照品溶液系列,置4℃冰箱保存。取對(duì)照品水溶液系列,按每100μL加入空白血漿900μL稀釋,得濃度為0.78,1.56,3.12,6.25,12.5,25,50,100,300ng·mL-1對(duì)照品血漿系列,置-20℃保存?zhèn)溆谩?.2內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱(chēng)定鹽酸洛拉曲克內(nèi)標(biāo)7.0mg,置250mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,精密量取1mL置50mL量瓶中,加水稀釋至刻度,得560ng·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液,置4℃冰箱保存,備用。4樣品處理和回用精密吸取血漿樣品1.0mL,置5mLPE離心管中,加入560ng·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液0.1mL,4%氨水1mL堿化稀釋,旋渦混勻。采用固相萃取法處理樣品,操作程序?yàn)?用1mL甲醇活化,上樣,分別用去離子水1mL、5%甲醇1mL淋洗雜質(zhì),再用于4℃放置2h以上的冷凍甲醇3mL洗脫,收集洗脫液,于真空干燥器中抽干,殘?jiān)眉状?.25mL溶解,由自動(dòng)進(jìn)樣器取5μL進(jìn)樣。記錄質(zhì)譜色譜圖,采用峰面積以?xún)?nèi)標(biāo)法定量。5溶劑中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾主軸取空白血漿、空白血漿加對(duì)照品(25ng·mL-1)及健康志愿者服藥后1.5h血漿樣品,按“4”項(xiàng)下方法操作,得LC-MS色譜圖,見(jiàn)圖2。由圖可知,噴托維林的保留時(shí)間約為6.4min,內(nèi)標(biāo)洛拉曲克的保留時(shí)間約為4.7min,空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾主峰。另外考察了5個(gè)來(lái)自不同個(gè)體的空白生物樣品色譜圖,結(jié)果在主峰位置均無(wú)雜質(zhì)峰。經(jīng)基質(zhì)效應(yīng)考察,結(jié)果被測(cè)的準(zhǔn)分子離子峰不受基質(zhì)效應(yīng)影響。6線性范圍與定量下限配制濃度為0.78,1.56,3.12,6.25,12.5,25,50,100,300ng·mL-1的對(duì)照品血漿系列,同“4”項(xiàng)下方法操作,利用加權(quán)最小二乘法(權(quán)重因子1/X),以噴托維林峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行回歸計(jì)算,回歸方程為:Y=0.0421X-0.01744r=0.998線性范圍為0.78～300ng·mL-1,定量下限為0.78ng·mL-1。7加標(biāo)回收率及精密度計(jì)算配制低、中、高濃度(1.56,12.5,100ng·mL-1)的對(duì)照品血漿各5份,同“4”項(xiàng)下方法操作,代入線性方程計(jì)算濃度,以測(cè)得值與加入值的比值計(jì)算相對(duì)回收率,并計(jì)算日內(nèi)精密度。同法連續(xù)3d配制相同低、中、高濃度的對(duì)照品血漿,并測(cè)定,考察日間精密度。3個(gè)濃度的相對(duì)回收率均在85%～115%范圍內(nèi),見(jiàn)表1;日內(nèi)、日間RSD均小于15%,見(jiàn)表2。8對(duì)照品溶液的制備配制低、中、高濃度(1.56,12.5,100ng·mL-1)對(duì)照品血漿各5份,按“4”項(xiàng)下方法操作;另取空白血漿4份,除不加內(nèi)標(biāo)外,同法萃取樣品,洗脫液分別加入6.25,50,400ng·mL-1的對(duì)照品水溶液及224ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)水溶液各0.25mL,于真空干燥器中抽干,殘?jiān)眉状?.25mL溶解,各進(jìn)樣5μL。比較上述2種方法測(cè)得的峰面積,計(jì)算提取回收率。結(jié)果噴托維林低、中、高濃度平均提取回收率均在70%～80%之間,內(nèi)標(biāo)平均提取回收率約為81%。見(jiàn)表3。9凍融穩(wěn)定性測(cè)定配制濃度為12.5ng·mL-1的對(duì)照品血漿,在室溫條件下放置0,5,10,12h,分別測(cè)定,考察室溫穩(wěn)定性,結(jié)果測(cè)得上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度分別為11.3,14.1,11.6,13.7ng·mL-1,RSD為10.9%;同一濃度對(duì)照品血漿,在-20℃冷凍24h后取出,室溫融化,測(cè)定,重復(fù)操作4次,考察凍融穩(wěn)定性,結(jié)果測(cè)得凍融0,1,2,3次的濃度分別為13.3,11.3,12.6,10.6ng·mL-1,RSD為10.2%;同一濃度對(duì)照品血漿,在-20℃冰箱中放置0,5,15,23d,測(cè)定濃度,考察冷凍穩(wěn)定性,結(jié)果測(cè)得上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度分別為11.3,12.7,11.7,11.7ng·mL-1,RSD為4.9%。血漿中枸櫞酸噴托維林在室溫放置12h,-20℃反復(fù)凍融4次,以及-20℃放置23d,結(jié)果穩(wěn)定,RSD均小于15%。10平均血藥濃度-時(shí)間曲線3名男性健康志愿者,年齡19～24歲,體重54～75kg,身高164～175cm,無(wú)煙酒嗜好。試驗(yàn)前經(jīng)病史詢(xún)問(wèn)、體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查均未發(fā)現(xiàn)異常。受試者無(wú)藥物過(guò)敏史和藥物依賴(lài)史,無(wú)精神病史以及其他慢性疾病史。試驗(yàn)前2周內(nèi)未服用任何藥物。受試期間禁煙酒及含咖啡因的飲料,統(tǒng)一清淡飲食。試驗(yàn)經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),受試者均簽署知情同意書(shū)。試驗(yàn)前禁食12h,受試者于清晨以溫開(kāi)水250mL口服25mg枸櫞酸噴托維林片,服藥2h后自由飲水,4h后統(tǒng)一進(jìn)餐。噴托維林半衰期約2～3h,故采血點(diǎn)設(shè)置至15h(約5個(gè)半衰期)。在給藥前及給藥后0.25,0.5,0.75,1.0,1.5,2,3,4,6,10,15h,抽取肘靜脈血4mL,注入肝素試管中,立即分離血漿(3000r·min-1,15min),于-20℃以下條件保存,待測(cè)。試驗(yàn)期間未見(jiàn)不良事件發(fā)生。血漿樣品,按本法測(cè)定。3名健康受試者口服25mg枸櫞酸噴托維林片后平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3。主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。結(jié)果提示,當(dāng)采血時(shí)間達(dá)約5個(gè)半衰期(15h)時(shí),血漿樣品中枸櫞酸噴托維林濃度均大于0.78ng·mL-1,本法靈敏度可滿(mǎn)足枸櫞酸噴托維林體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究的要求。11治療血藥濃度本文對(duì)HPLC-MS/ESI+法測(cè)定人血漿中枸櫞酸噴托維林的濃度進(jìn)行了方法學(xué)研究。結(jié)果表明,本法特異性強(qiáng),靈敏度高,結(jié)果準(zhǔn)確,精密度符合要求,血漿樣品在實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定。方法操作簡(jiǎn)便,條件易控,可用于枸櫞酸噴托維林常用劑量口服給藥后,體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究及生物等效性評(píng)價(jià)中血藥濃度分析,亦可用于臨床治療藥物監(jiān)測(cè)。噴托維林及洛拉曲克均為弱堿性化合物,成鹽后水溶性強(qiáng),在固相萃取中不利于與內(nèi)源性水溶性雜質(zhì)的分離,故上樣前需對(duì)血漿樣品進(jìn)行堿化,使被測(cè)組分以分子形式游離出來(lái),通過(guò)固相吸附作用達(dá)到與雜質(zhì)分離的目的。試驗(yàn)中使用4%氨水1mL處理樣品,不僅可以起到堿化作用,同時(shí)又可以對(duì)樣品進(jìn)行稀釋,降低血漿粘稠度,使