食品中營養(yǎng)成分的檢驗(yàn)-食品中蛋白質(zhì)和氨基酸的測定

蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識一蛋白質(zhì)的測定方法二氨基酸基礎(chǔ)知識三氨基酸的測定方法四氨基酸測定的基礎(chǔ)知識氨基酸態(tài)氮的測定方法雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法氨基酸的測定方法氨基酸的測定方法一、氨基酸測定基礎(chǔ)知識鑒于食物中氨基酸成分的復(fù)雜性，對食物中氨基酸含量的測定，在一般的常規(guī)檢驗(yàn)中多測定樣品中的氨基酸總量。由于氨基酸中的含氮量可以直接測定，不同于蛋白質(zhì)的氮，故可通過測定食物中的氨基酸態(tài)氮確定食物中的氨基酸含量。測定“氨基酸含量”與測定“氨基酸態(tài)氮含量”的關(guān)系氨基酸的測定方法二、氨基酸的測定方法雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法氨基酸分析儀近紅外反射分析儀簡單易行、快速方便，適用于測定游離的氨基酸，測定的結(jié)果僅表示α—氨基酸態(tài)氮的含量，精確度為90%。準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定，不受樣品顏色深淺的干擾。酸堿滴定法，利用氨基酸的兩性特性測定?？煽焖贉?zhǔn)確地測出各種氨基酸的含量。氨基酸的測定方法三、雙指示劑甲醛滴定法（一）雙指示劑甲醛滴定法的原理

氨基酸含有酸性的—COOH，也含有堿性的—NH2，它們互相作用使氨基酸成為中性內(nèi)鹽，不能直接用堿液滴定它的羧基，當(dāng)加入甲醛時，—NH2與甲醛結(jié)合，其堿性消失，使—COOH顯示出酸性，可用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，并用間接的方法測定氨基酸總量。氨基酸的測定方法三、雙指示劑甲醛滴定法（二）器材與試劑1主要器材：堿式滴定管、鐵架臺、蝶形夾、錐形瓶等。2試劑：40%中性甲醛溶液、0.1%百里酚酞乙醇溶液、0.1%中性紅50%乙醇溶液、0.1mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。氨基酸的測定方法三、雙指示劑甲醛滴定法（三）操作方法取樣（約20mg氨基酸）2份于250ml錐形瓶，各加50ml蒸餾水1份加3d百里酚酞指示劑及20ml中性甲醛，搖勻，靜置1min0.1mol/LNaOH標(biāo)液滴定（至淡藍(lán)色為終點(diǎn)）1份加3d中性紅指示劑0.1mol/LNaOH標(biāo)液滴定（由紅色變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn)）記錄堿液消耗體積（mL）氨基酸的測定方法三、雙指示劑甲醛滴定法（四）結(jié)果計(jì)算X——樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100mL；V1——百里酚酞作指示劑時消耗NaOH標(biāo)液體積，mL；V2——中性紅作指示劑時消耗NaOH標(biāo)液的體積，mL；C——NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；0.014——1mL1.000mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)于氮的質(zhì)量，g；V——樣品的體積，mL；V3——樣品稀釋液的總體積，mL；V4——樣品稀釋液的取用量，mL。氨基酸的測定方法三、雙指示劑甲醛滴定法（五）注意事項(xiàng)1、固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃?。ㄝ腿】稍?0℃水浴中進(jìn)行0.5h即可），然后測定萃取液；液體試樣，如醬油、飲料等可直接吸取試樣進(jìn)行測定；2、若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定，或用電位滴定法測定；3、與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和－COOH時的pH為8.5～9.5，但分析結(jié)果稍偏低，即雙指示劑法的結(jié)果更準(zhǔn)確。氨基酸的測定方法四、電位滴定法（一）電位滴定法的原理

根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成電池，用NaOH標(biāo)液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷終點(diǎn)。氨基酸的測定方法四、電位滴定法（二）器材與試劑1主要器材：酸度計(jì)、磁力攪拌器、堿式滴定管、鐵架臺、蝶形夾、錐形瓶等。2試劑：40%中性甲醛溶液、0.05mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。氨基酸的測定方法四、電位滴定法（三）操作方法取樣（5ml樣品，加水定容至100ml，取20ml）于燒杯中加60ml蒸餾水，開動磁力攪拌器，0.05mol/LNaOH標(biāo)液滴定至pH8.2加10ml甲醛，混勻，0.05mol/LNaOH標(biāo)液滴定至pH9.2，記錄消耗體積同時取水80ml，做試劑空白試驗(yàn)記錄NaOH溶液的消耗體積氨基酸的測定方法四、電位滴定法（四）結(jié)果計(jì)算X——樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100mL；V1——空白試驗(yàn)加入甲醛后滴定至終點(diǎn)所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2——測定樣品在加入甲醛后滴定至終點(diǎn)（pH9.2）所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C——NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；0.014——1mL1.000mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)于氮的質(zhì)量，g；V——樣品的體積，mL；V3——樣品稀釋液的總體積，mL；V4——樣品稀釋液的取用量，mL。氨基酸的測定方法四、電位滴定法（五）注意事項(xiàng)1、標(biāo)準(zhǔn)pH緩沖液按規(guī)定配制好后為避免其pH值發(fā)生變化，存放時間不應(yīng)過長，否則將直接影響滴定終點(diǎn)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確；2、久置的復(fù)合電極初次使用時，要先在飽和KCl溶液中浸泡24h以上；3、本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定；4、對于渾濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測定。蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識一蛋白質(zhì)的測定方法二氨基酸基礎(chǔ)知識三氨基酸的測定方法四氨基酸的定義氨基酸的組成特點(diǎn)氨基酸的存在形式氨基酸的分類氨基酸的測定意義氨基酸基礎(chǔ)知識氨基酸基礎(chǔ)知識一、氨基酸的定義

氨基酸（Aminoacid）是指含有氨基的羧酸，是組成蛋白質(zhì)的基本單位，賦予蛋白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu)形態(tài)，使他的分子具有生化活性。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸都是一類含有羧基并在與羧基相連的碳原子下連有氨基的有機(jī)化合物，目前自然界中尚未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中有氨基和羧基不連在同一個碳原子上的氨基酸。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本成分。氨基酸基礎(chǔ)知識二、氨基酸的組成特點(diǎn)

氨基酸是指含有氨基的羧酸，生物體內(nèi)的各種蛋白質(zhì)是由20多種基本氨基酸構(gòu)成的。其結(jié)構(gòu)通式如下（R基為可變基團(tuán)）：（一）氨基酸的組成結(jié)構(gòu)氨基酸基礎(chǔ)知識二、氨基酸的組成特點(diǎn)（二）氨基酸的構(gòu)型

組成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸中，除甘氨酸外，其它蛋白質(zhì)氨基酸的α－碳原子均為不對稱碳原子（即與α－碳原子鍵合的四個取代基各不相同），因此氨基酸可以有立體異構(gòu)體，即可以有不同的構(gòu)型（D－型與L－型兩種構(gòu)型）氨基酸基礎(chǔ)知識三、氨基酸的存在形式蛋白質(zhì)氨基酸：組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20多種，其中8種為人體必需氨基酸，分別為賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸。非蛋白質(zhì)氨基酸：已發(fā)現(xiàn)有150多種，存在于各種細(xì)胞組織中，呈游離狀態(tài)或結(jié)合狀態(tài)，其氮為非蛋白氮。氨基酸基礎(chǔ)知識四、氨基酸的分類必需氨基酸：8種人體必需氨基酸，分別為賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸；半必需和條件必需氨基酸：例如精氨酸、組氨酸；非必需氨基酸：例如甘氨酸、丙氨酸等。指人體（或其他脊椎動物）不能合成，或合成速度遠(yuǎn)不適應(yīng)機(jī)體的需要，必須由食物蛋白供給。人體能夠合成，但通常不能滿足正常的需要。指人（或其他脊椎動物）自己能簡單的前提合成，不需要從食物中獲得的氨基酸。氨基酸基礎(chǔ)知識五、氨基酸的測定意義氨基酸基礎(chǔ)知識五、氨基酸的測定意義評價(jià)食物的營養(yǎng)價(jià)值，改善人們的營養(yǎng)指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)，防止氨基酸缺乏或過量補(bǔ)充不同食品中氨基酸的含量不同，可作為質(zhì)量檢驗(yàn)的重要手段合理開發(fā)利用食物資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食物配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及控制生產(chǎn)過程蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識一蛋白質(zhì)的測定方法二氨基酸基礎(chǔ)知識三氨基酸的測定方法四目的與要求原理試劑與器材操作要點(diǎn)結(jié)果分析注意事項(xiàng)思考與討論氨基酸態(tài)氮的測定—雙指示劑法氨基酸態(tài)氮的測定—雙指示劑法一、目的與要求學(xué)習(xí)雙指示劑甲醛滴定法測定農(nóng)產(chǎn)品中氨基酸總量的基本原理和操作方法；掌握滴定管的使用方法和滴定終點(diǎn)的判斷。氨基酸態(tài)氮含量測定的目的與要求二、原理雙指示劑發(fā)測定氨基酸態(tài)氮含量的原理氨基酸含有酸性的—COOH，也含有堿性的—NH2，它們互相作用使氨基酸成為中性內(nèi)鹽，不能直接用堿液滴定它的羧基，當(dāng)加入甲醛時，—NH2與甲醛結(jié)合，其堿性消失，使—COOH顯示出酸性，可用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，并用間接的方法測定氨基酸總量。氨基酸態(tài)氮的測定—雙指示劑法三、器材與試劑1主要器材：堿式滴定管、鐵架臺、蝶形夾、錐形瓶等。材料：香菇2試劑：40%中性甲醛溶液、0.1%百里酚酞乙醇溶液、0.1%中性紅50%乙醇溶液、0.1mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。氨基酸態(tài)氮的測定—雙指示劑法四、操作要點(diǎn)氨基酸態(tài)氮的測定—雙指示劑法記錄堿液消耗體積（mL）取樣（約20mg氨基酸）2份于250ml錐形瓶，各加50ml蒸餾水1份加3d百里酚酞指示劑及20ml中性甲醛，搖勻，靜置1min1份加3d中性紅指示劑0.1mol/LNaOH標(biāo)液滴定（至淡藍(lán)色為終點(diǎn)）0.1mol/LNaOH標(biāo)液滴定（由紅變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn)）五、結(jié)果與分析1.數(shù)據(jù)記錄表1數(shù)據(jù)記錄表項(xiàng)目第一次第二次第三次平均值中性紅作指示劑時消耗NaOH標(biāo)液的體積（mL）

百里酚酞作指示劑時消耗NaOH標(biāo)液體積（mL）

氨基酸態(tài)氮的測定—雙指示劑法五、結(jié)果與分析2.結(jié)果計(jì)算X——樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100mL；V1——百里酚酞作指示劑時消耗NaOH標(biāo)液體積，mL；V2——中性紅作指示劑時消耗NaOH標(biāo)液的體積，mL；C——NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；0.014——1mL1.000mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)于氮的質(zhì)量，g；V——樣品的體積，mL；V3——樣品稀釋液的總體積，mL；V4——樣品稀釋液的取用量，mL。氨基酸態(tài)氮的測定—雙指示劑法六、注意事項(xiàng)雙指示劑甲醛滴定法測定氨基酸態(tài)氮時需要說明的問題及注意事項(xiàng)如下：1、固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃?。ㄝ腿】稍?0℃水浴中進(jìn)行0.5h即可），然后測定萃取液；液體試樣，如醬油、飲料等可直接吸取試樣進(jìn)行測定；2、若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定，或用電位滴定法測定；3、與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和－COOH時的pH為8.5～9.5，但分析結(jié)果稍偏低，即雙指示劑法的結(jié)果更準(zhǔn)確。氨基酸態(tài)氮的測定—雙指示劑法七、思考與討論1．檢測時為什么要加入甲醛？2．根據(jù)實(shí)訓(xùn)結(jié)果，探討產(chǎn)生實(shí)訓(xùn)誤差的原因。氨基酸態(tài)氮的測定—雙指示劑法蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識一蛋白質(zhì)的測定方法二氨基酸基礎(chǔ)知識三氨基酸的測定方法四蛋白質(zhì)測定的基本原理蛋白質(zhì)的測定方法凱氏定氮法蛋白質(zhì)的測定方法蛋白質(zhì)的測定方法一、蛋白質(zhì)測定的基本原理根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和成分，其測定的基本原理主要有以下兩個方面：利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)含量；利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團(tuán)以及芳香基團(tuán)等測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)的測定方法二、蛋白質(zhì)的測定方法凱氏定氮法雙縮脲法（Biuret法）紫外分光光度計(jì)法酚試劑法（Lowry法）考馬斯亮藍(lán)法適用于0.2～1.0mg氮,誤差為±2％,用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測定；干擾少,靈敏度低,費(fèi)時長。較快速，不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色深淺相近，干擾物質(zhì)少，靈敏度差。常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。簡便、靈敏、快速、不消耗樣品,準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多。適用于測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組成相似的蛋白質(zhì)。靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，費(fèi)時間較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。靈敏度高，測定快速簡便，干擾物質(zhì)少。由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。蛋白質(zhì)的測定方法三、凱氏定氮法（一）凱氏定氮法的原理消化蒸餾吸收滴定樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。將消化好的樣品加堿蒸餾，使氨蒸出。用硼酸溶液吸收氨氣。再用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定,根據(jù)酸的消耗量計(jì)算。蛋白質(zhì)的測定方法三、凱氏定氮法（二）器材與試劑1主要器材：消化管、消化爐、定氮儀、酸式滴定管、鐵架臺、蝶形夾、錐形瓶等。2試劑：濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、NaOH溶液400g/L、HCL標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mol/L或0.01mol/L、硼酸溶液40g/L、甲基紅-溴甲酚綠指示劑（2g/L）5:1）蛋白質(zhì)的測定方法三、凱氏定氮法（三）操作方法1.取樣取樣量0.2～2.0g固體樣品取樣量2.0～5.0g半固體樣品取樣量10.0～20.0mL液體樣品于干燥潔凈的消化管內(nèi)蛋白質(zhì)的測定方法三、凱氏定氮法（三）操作方法2.消化將消化管放入消化爐，先采用低溫加熱(180℃左右)，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，提高消化溫度(370℃~420℃)，保持消化管內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h~1h，取下放冷。同時做試劑空白試驗(yàn)。1、加入稱量好的樣品2、加入催化劑（CuSO4與K2SO4的混合物，1:20）3、加入濃硫酸蛋白質(zhì)的測定方法三、凱氏定氮法（三）操作方法3.蒸餾與吸收堿液硼酸蒸餾水樣品加水稀釋接收瓶內(nèi)加入硼酸堿液加入消化管開始蒸餾氨被蒸出循環(huán)水冷凝氨被吸收蛋白質(zhì)的測定方法三、凱氏定氮法（三）操作方法4.滴定硼酸吸收液蒸餾滴定加入指示劑后溶液為藍(lán)色指示劑滴定后溶液為微紅色標(biāo)準(zhǔn)酸蛋白質(zhì)的測定方法三、凱氏定氮法（四）結(jié)果計(jì)算X——樣品蛋白質(zhì)含量，g/100g；V1——樣品滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液的體積，mL；V2——空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液的體積，mL；C——標(biāo)準(zhǔn)HCl滴定溶液的濃度，mol/L；0.014——1mL鹽酸[c(HCl)=1.000mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)于氮的質(zhì)量，g；m——樣品的質(zhì)量，g；F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。蛋白質(zhì)的測定方法三、凱氏定氮法（五）注意事項(xiàng)1、取樣量較大時，消化時每克試樣增加5mlH2SO4的量；2、蒸餾前若加堿量不足，消化液不生成Cu(OH)2沉淀，增加堿用量；3、消化時，若樣品含糖高或含脂較多時，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失。可加入少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn)生；4、硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40℃，否則對氨的吸收作用減弱，造成檢測結(jié)果偏低?？砂呀邮掌恐糜诶渌≈?。常量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量時需要說明的問題及注意事項(xiàng)如下：蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識一蛋白質(zhì)的測定方法二氨基酸基礎(chǔ)知識三氨基酸的測定方法四原理器材與試劑操作方法結(jié)果計(jì)算注意事項(xiàng)蛋白質(zhì)的測定方法

——分光光度法蛋白質(zhì)的測定方法分光光度法（一）分光光度法的原理食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm下測定吸光度值，，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)的測定方法分光光度法（二）器材與試劑1主要器材：分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴鍋、10mL具塞玻璃比色管、天平（感量為1mg。2試劑：濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、NaOH溶液300g/L、1g/L對硝基苯酚1mol/L乙酸、1mol/L乙酸鈉、乙酸鈉-乙酸緩沖溶液、甲醛、乙酰丙酮等。蛋白質(zhì)的測定方法分光光度法（三）操作方法1.取樣取樣量0.1～0.5g（精確至0.001g）固體樣品取樣量0.2～1g（精確至0.001g）半固體樣品取樣量1～5g（精確至0.001g）液體樣品于干燥潔凈的消化管內(nèi)蛋白質(zhì)的測定方法分光光度法（三）操作方法2.消化將消化管放入消化爐，先采用低溫加熱(180℃左右)，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，提高消化溫度(370℃~420℃)，保持消化管內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h~1h，取下放冷。同時做試劑空白試驗(yàn)。1、加入稱量好的樣品2、加入催化劑（CuSO4與K2SO4的混合物，1:20）3、加入濃硫酸蛋白質(zhì)的測定方法分光光度法（三）操作方法3.消化液定容放冷后的消化液和試劑空白液分別移入50mL或100mL容量瓶中，并用少量水洗消化管，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。蛋白質(zhì)的測定方法分光光度法（三）操作方法4.試液制備吸取2.00~5.00mL試樣或試劑空白消化液于50mL或100mL容量瓶中，加1滴~2滴對硝基苯酚指示劑溶液，搖勻后滴加氫氧化鈉溶液中和至黃色，再滴加乙酸溶液至溶液無色，用水稀釋至刻度，混勻。蛋白質(zhì)的測定方法分光光度法（三）操作方法5.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制比色管號12345678氨氮標(biāo)液（mL）0.000.050.100.200.400.600.801.00乙酸鈉-乙酸緩沖溶液（mL）4.04.04.04.04.04.04.04.0顯色劑（甲醛-乙酰丙酮）（mL）4.04.04.04.04.04.04.04.0

將各比色管加水至10mL刻度，混勻。置于100℃水浴中加熱15min。取出用水冷卻至室溫后，移入1cm比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長400nm處測量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)個點(diǎn)吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算直線回歸方程。蛋白質(zhì)的測定方法分光光度法（三）操作方法6.試液測定吸取0.50~2.00mL（約相當(dāng)于氮小于100μg）試樣溶液和同量的試劑空白溶液，分別于10mL比色管中。以下按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作步驟中自“加4.0mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液（pH4.8）及4.0mL顯色劑……”起依法操作。試樣吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程求出含量。蛋白質(zhì)的測定方法分光光度法（四）結(jié)果計(jì)算X——試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100g或g/100mL；C——試樣測定液中氮的含量，μg；C0——試劑空白測定液中氮的含量，μg；V1——試樣消化液定容體積，mL；V2——制備試樣溶液的消化液體積，mL；V3——試樣溶液總體積，mL；V4——測定用試樣溶液體積，mL；m——試樣質(zhì)量或體積，g或mL；F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。蛋白質(zhì)的測定方法分光光度法（五）注意事項(xiàng)1、本法適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測定，不適用于添加無機(jī)含氮物質(zhì)、有機(jī)非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)的食品測定；2、當(dāng)稱樣量為5.0g，定量檢出限為0.1mg/100g。分光光度法測定蛋白質(zhì)含量時需要說明的問題及注意事項(xiàng)如下：蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識一蛋白質(zhì)的測定方法二氨基酸基礎(chǔ)知識三氨基酸的測定方法四蛋白質(zhì)的定義蛋白質(zhì)的組成特點(diǎn)蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的測定意義蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識一、蛋白質(zhì)的定義蛋白質(zhì)（protein）是由許多氨基酸通過肽鍵相連形成的高分子含氮化合物，氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。蛋白質(zhì)就是構(gòu)成人體組織器官的支架和主要物質(zhì)，在人體生命活動中，起著重要作用，可以說沒有蛋白質(zhì)就沒有生命活動的存在。每天的飲食中蛋白質(zhì)主要存在于瘦肉、蛋類、豆類及魚類中。主要元素組成(％)為：C（50～55）；H（6～8）；O（20～30）；N（15～18）；S（0～4）。另外，有些蛋白質(zhì)含有少量的P或金屬元素Fe、Zn、Cu

、Mn、Co、Mo，個別蛋白質(zhì)還含有l(wèi)等元素。蛋白質(zhì)的元素組成蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識二、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成根據(jù)蛋白質(zhì)的元素組成，可以將蛋白質(zhì)的組成特點(diǎn)簡單概括如下：蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識二、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成一切蛋白質(zhì)都含有N元素，且各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16%；蛋白質(zhì)系數(shù)：任何生物樣品中每1g元N的存在，就表示大約有100/16=6.25g蛋白質(zhì)的存在，6.25常稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)從營養(yǎng)價(jià)值出發(fā)，蛋白質(zhì)可分為三類：蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識三、蛋白質(zhì)的分類完全蛋白質(zhì)：奶、蛋、魚、肉中的蛋白質(zhì)；半完全蛋白質(zhì)：小麥中的麥膠蛋白，含賴氨酸很少；不完全蛋白質(zhì)：肉皮中的膠原蛋白。這是一類優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。它們所含的必需氨基酸種類齊全，數(shù)量充足，彼此比例適當(dāng)。這一類蛋白質(zhì)不但可以維持人體健康，還可以促進(jìn)生長發(fā)育。這類蛋白質(zhì)所含氨基酸雖然種類齊全，但其中某些氨基酸的數(shù)量不能滿足人體的需要。它們可以維持生命，但不能促進(jìn)生長發(fā)育。這類蛋白質(zhì)不能提供人體所需的全部必需氨基酸，單純靠它們既不能促進(jìn)生長發(fā)育，也不能維持生命。蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識四、蛋白質(zhì)測定的意義蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識四、蛋白質(zhì)測定的意義評價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值，改善人們的營養(yǎng)指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)缺乏或過量補(bǔ)充不同食品中蛋白質(zhì)的含量不同，可作為質(zhì)量檢驗(yàn)的重要手段合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及控制生產(chǎn)過程蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識一蛋白質(zhì)的測定方法二氨基酸基礎(chǔ)知識三氨基酸的測定方法四目的與要求原理試劑與器材操作要點(diǎn)結(jié)果分析注意事項(xiàng)思考與討論蛋白質(zhì)測定——分光光度法蛋白質(zhì)測定—分光光度法一、目的與要求學(xué)習(xí)分光光度法測定蛋白質(zhì)的基本原理；掌握分光光度法的操作技術(shù)，包括樣品的消化處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及蛋白質(zhì)含量計(jì)算等；掌握分光光度計(jì)的使用方法。蛋白質(zhì)測定—分光光度法二、原理食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm下測定吸光度值，，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)測定—分光光度法三、器材與試劑1主要器材：分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴鍋、10mL具塞玻璃比色管、天平（感量為1mg。材料：乳粉2試劑：濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、NaOH溶液300g/L、1g/L對硝基苯酚1mol/L乙酸、1mol/L乙酸鈉、乙酸鈉-乙酸緩沖溶液、甲醛、乙酰丙酮等。蛋白質(zhì)測定—分光光度法四、操作要點(diǎn)1.取樣取樣量0.1～0.5g（精確至0.001g）固體樣品取樣量0.2～1g（精確至0.001g）半固體樣品取樣量1～5g（精確至0.001g）液體樣品于干燥潔凈的消化管內(nèi)蛋白質(zhì)測定—分光光度法四、操作要點(diǎn)2.消化將消化管放入消化爐，先采用低溫加熱(180℃左右)，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，提高消化溫度(370℃~420℃)，保持消化管內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h~1h，取下放冷。同時做試劑空白試驗(yàn)。1、加入稱量好的樣品2、加入催化劑（CuSO4與K2SO4的混合物，1:20）3、加入濃硫酸蛋白質(zhì)測定—分光光度法四、操作要點(diǎn)3.消化液定容放冷后的消化液和試劑空白液分別移入100mL容量瓶中，并用少量水洗消化管，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。蛋白質(zhì)測定—分光光度法四、操作要點(diǎn)4.試液制備吸取2.00~5.00mL試樣或試劑空白消化液于100mL容量瓶中，加1滴~2滴對硝基苯酚指示劑溶液，搖勻后滴加氫氧化鈉溶液中和至黃色，再滴加乙酸溶液至溶液無色，用水稀釋至刻度，混勻。蛋白質(zhì)測定—分光光度法四、操作要點(diǎn)（三）操作方法5.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制比色管號12345678氨氮標(biāo)液（mL）0.000.050.100.200.400.600.801.00乙酸鈉-乙酸緩沖溶液（mL）4.04.04.04.04.04.04.04.0顯色劑（甲醛-乙酰丙酮）（mL）4.04.04.04.04.04.04.04.0

將各比色管加水至10mL刻度，混勻。置于100℃水浴中加熱15min。取出用水冷卻至室溫后，移入1cm比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長400nm處測量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)個點(diǎn)吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算直線回歸方程。蛋白質(zhì)測定—分光光度法四、操作要點(diǎn)6.試液測定吸取0.50~2.00mL（約相當(dāng)于氮小于100μg）試樣溶液和同量的試劑空白溶液，分別于10mL比色管中。以下按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作步驟中自“加4.0mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液（pH4.8）及4.0mL顯色劑……”起依法操作。試樣吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程求出含量。蛋白質(zhì)測定—分光光度法五、結(jié)果分析1.數(shù)據(jù)記錄表1數(shù)據(jù)記錄表比色管號12345678樣液體積空白試液氨氮標(biāo)液（mL）0.000.050.100.200.400.600.801.001.001.00乙酸鈉-乙酸緩沖溶液（mL）4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0顯色劑（甲醛-乙酰丙酮）（mL）4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0定容體積定容至10mL測定吸光度值蛋白質(zhì)測定—分光光度法五、結(jié)果分析2.結(jié)果計(jì)算X——試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100g或g/100mL；C——試樣測定液中氮的含量，μg；C0——試劑空白測定液中氮的含量，μg；V1——試樣消化液定容體積，mL；V2——制備試樣溶液的消化液體積，mL；V3——試樣溶液總體積，mL；V4——測定用試樣溶液體積，mL；m——試樣質(zhì)量或體積，g或mL；F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。蛋白質(zhì)測定—分光光度法六、注意事項(xiàng)分光光度法測定蛋白質(zhì)含量時需要說明的問題及注意事項(xiàng)如下：1、本法適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測定，不適用于添加無機(jī)含氮物質(zhì)、有機(jī)非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)的食品測定；2、當(dāng)稱樣量為5.0g，定量檢出限為0.1mg/100g。蛋白質(zhì)測定—分光光度法七、思考與討論1．樣品消化時加入硫酸銅、硫酸鉀的作用是什么？2．實(shí)驗(yàn)操作過程中，影響測定準(zhǔn)確性的因素有哪些？蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識一蛋白質(zhì)的測定方法二氨基酸基礎(chǔ)知識三氨基酸的測定方法四目的與要求原理試劑與器材操作要點(diǎn)結(jié)果分析注意事項(xiàng)思考與討論氨基酸態(tài)氮的測定—電位滴定法氨基酸態(tài)氮的測定—電位滴定法一、目的與要求學(xué)習(xí)電位滴定法測定農(nóng)產(chǎn)品中氨基酸總量的基本原理和操作方法；掌握pH計(jì)的使用方法和滴定基本操作。氨基酸態(tài)氮含量測定的目的與要求滴定裝置二、原理醬油中總氨基酸態(tài)氮含量測定的原理根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成電池，用NaOH標(biāo)液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷終點(diǎn)。氨基酸態(tài)氮的測定—電位滴定法三、器材與試劑1主要器材：酸度計(jì)、磁力攪拌器、堿式滴定管、鐵架臺、蝶形夾、錐形瓶等。材料：醬油2試劑：40%中性甲醛溶液、0.05mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。氨基酸態(tài)氮的測定—電位滴定法四、操作要點(diǎn)取樣（吸取5ml醬油，加水定容至100ml，取20ml）于燒杯中氨基酸態(tài)氮的測定—電位滴定法取樣（吸取5ml醬油，加水定容至100ml，取20ml）于燒杯中加60ml蒸餾水，開動磁力攪拌器，0.05mol/LNaOH標(biāo)液滴定至pH8.2加10ml甲醛，混勻，0.05mol/LNaOH標(biāo)液滴定至pH9.2，記錄消耗體積同時取水80ml，做試劑空白試驗(yàn)記錄NaOH溶液的消耗體積五、結(jié)果與分析1.數(shù)據(jù)記錄表1數(shù)據(jù)記錄表項(xiàng)目第一次第二次第三次平均值樣液加入甲醛后滴定至pH9.2消耗NaOH體積（mL）

空白液加入甲醛后滴定至pH9.2消耗NaOH體積（mL）

氨基酸態(tài)氮的測定—電位滴定法五、結(jié)果與分析2.結(jié)果計(jì)算X——樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100mL；V1——空白試驗(yàn)加入甲醛滴定至終點(diǎn)（pH9.2）消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2——測定樣品在加入甲醛后滴定至終點(diǎn)（pH9.2）所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；C——NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；0.014——1mL1.000mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)于氮的質(zhì)量，g；V——樣品的體積，mL；V3——樣品稀釋液的總體積，mL；V4——樣品稀釋液的取用量，mL。氨基酸態(tài)氮的測定—電位滴定法六、注意事項(xiàng)電位滴定法測定氨基酸態(tài)氮時需要說明的問題及注意事項(xiàng)如下：1、標(biāo)準(zhǔn)pH緩沖液按規(guī)定配制好后為避免其pH值發(fā)生變化，存放時間不應(yīng)過長，否則將直接影響滴定終點(diǎn)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確；2、久置的復(fù)合電極初次使用時，要先在飽和KCl溶液中浸泡24h以上；3、本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定；4、對于渾濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測定。氨基酸態(tài)氮的測定—電位滴定法七、思考與討論1．檢測時為什么要加入甲醛？2．根據(jù)實(shí)訓(xùn)結(jié)果，探討產(chǎn)生實(shí)訓(xùn)誤差的原因。氨基酸態(tài)氮的測定—電位滴定法蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識一蛋白質(zhì)的測定方法二氨基酸基礎(chǔ)知識三氨基酸的測定方法四目的與要求原理試劑與器材操作要點(diǎn)結(jié)果分析注意事項(xiàng)思考與討論蛋白質(zhì)測定——凱氏定氮法蛋白質(zhì)測定—凱氏定氮法一、目的與要求學(xué)習(xí)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的基本原理；掌握凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括樣品的消化處理、蒸餾、吸收、滴定及蛋白質(zhì)含量計(jì)算等；掌握凱氏定氮儀的使用方法。蛋白質(zhì)測定