差速離心對j亞群禽白血病分離株scau11-h生物學(xué)活性的影響

差速離心對j亞群禽白血病分離株scau11-h生物學(xué)活性的影響

關(guān)于鳥類疾病的形態(tài)，已經(jīng)進行了關(guān)于感染鳥類疾病的超微細胞成像的研究，以及對不同組織分布的如腔袋、腎和脾的超微細胞的研究。結(jié)果表明，完整的革蘭氏病變球形，整個病毒直徑為80120nm，平均約90nm。禽腫瘤病毒在高溫下很快滅活,在37℃下的半衰期從100min到540min不等(平均大約260min);在-15℃條件下,半衰期低于1周。病毒感染力的熱不穩(wěn)定性成為病毒保存中的關(guān)鍵因素,溫度也成為實驗操作中保證病毒生物學(xué)活性的重要考慮因素。禽白血病病毒在細胞上培養(yǎng)周期長,一般需7~9d,普通傳代細胞培養(yǎng)上清所含病毒滴度大約105TCID50,在實驗室通過傳統(tǒng)接毒盲傳提高病毒滴度耗費時間長,也極易造成不同亞群間的交叉污染。超速離心可以使病毒樣本濃縮100倍甚至更高,濃縮后的病毒是否具有生物學(xué)活性成為影響后續(xù)試驗研究的關(guān)鍵因素。為此,本研究通過實時熒光定量RT-PCR、IFA和ELISA等方法驗證差速離心后濃縮病毒的生物學(xué)活性。1材料和方法1.1創(chuàng)創(chuàng)期實驗單位J亞群禽白血病分離株SCAU11-H,由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室提供(GenBank登錄號:KC149972.1)。DF-1細胞來源于美國ATCC,ALV-Jgp85單抗JE9由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院秦愛建教授惠贈。1.2細胞培養(yǎng)及遺傳穩(wěn)定性檢測DF-1細胞和CEF細胞培養(yǎng)成單層后接種SCAU11-H,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7d后,用ALV抗原ELISA檢測試劑盒(IDEXX)檢測細胞培養(yǎng)上清,陽性樣品測定TCID50后保存于-70℃作為連續(xù)傳代的接種物。1.3凍融法培養(yǎng)抗菌液待CEF細胞在175cm2培養(yǎng)瓶(NEST)生長至對數(shù)生長期時接種SCAU11-H病毒,每瓶用1%FBS(Gibico)維持液20mL培養(yǎng)9d后反復(fù)凍融3次,5000r/min(4℃)條件下低速離心20min。再取上清于16000g/min(4℃)條件下用超速離心機(Optima)高速離心60min沉淀病毒粒子。去除上清后用400μLDMEM重懸濃縮病毒,分裝后取部分送往廣東省微生物研究所做透射電鏡觀察,其余存放在-70℃?zhèn)錂z。1.4病毒生物學(xué)活性的激活1.4.1病毒接種與檢測將濃縮后的病毒用DMEM作連續(xù)10倍稀釋(10-5-10-11),接種已長滿單層CEF細胞的96孔培養(yǎng)板,同時設(shè)正常CEF不接種病毒的對照,培養(yǎng)3d后通過IFA檢測測定病毒滴度。判定結(jié)果用Reed-Muenchcalculator(1938)軟件計算病毒的細胞半數(shù)感染劑量。1.4.2擴增目的產(chǎn)物根據(jù)已發(fā)表的SCAU11-H基因序列,設(shè)計檢測env基因的引物,上游引物5′-AATATTGAATGCGAT-GCTGGAAGAC-3′和下游引物5′-CTATGGGAT-CATCTTCTACCTGTAT-3′,擴增目的產(chǎn)物為221bp;根據(jù)已發(fā)表的雞內(nèi)參GAPDH(GenBank登錄號:NM_204305)基因序列設(shè)計引物,擴增目的產(chǎn)物為112bp,上游引物5′-GAACATCATCCCAGCGTCCA-3′和下游引物5′-CGGCAGGTCAGGTCAACAAC-3′。將濃縮后的SCAU11-H以105TCID50/0.2mL的感染劑量接種DF-1細胞,用試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)抽提細胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。目的基因和內(nèi)參基因擴增產(chǎn)物分別克隆進pMD18-T載體后送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序顯示序列正確。熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果通過2-△△Ct方法進行分析。1.4.3alv-jgp65單克隆抗體的制備CEF細胞消化至細胞培養(yǎng)板中,按照105TCID50/0.2mL劑量接種濃縮后的病毒SCAU11-H,培養(yǎng)3d后棄上清,預(yù)冷PBS洗滌后用4%多聚甲醛固定15min,4℃濕盒過夜孵育1∶200稀釋的抗ALV-Jgp85單克隆抗體。用PBST洗滌3次,加入1∶200稀釋的FITC-羊抗鼠IgG,37℃孵育1h,PBST洗滌后再用DAPI(碧云天)室溫染色15min,用PBST洗滌兩次后在熒光顯微鏡(Leica)下觀察。2結(jié)果2.1電子致密的囊膜圖1顯示,病毒粒子直徑為60~140nm,由外部的囊膜和內(nèi)部的電子致密的核心構(gòu)成,多近似球形,也有一些類似長桿形、鼓錘形的形態(tài)。2.2病毒生物學(xué)活性的測定2.2.1病毒滴度的變化表1顯示,濃縮前后SCAU11-H病毒的滴度(TCID50/mL)由原來的1.58×105/mL上升到8.89×1011/mL,說明濃縮后病毒滴度極大提高了。2.2.3細胞表面及胞漿的綠色熒光見中插彩版圖3顯示,感染組(左)呈陽性反應(yīng),細胞表面及胞漿均有明顯的綠色熒光(如紅色箭頭所示);對照組(右)為陰性,只有細胞核經(jīng)DAPI核染呈藍色,而細胞表面及胞漿沒有綠色熒光。3病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性本實驗室分離的血管瘤相關(guān)J亞群禽白血病分離株SCAU11-H是2011-2012年在廣東省商品肉種雞上分得。在細胞上傳代后ELISA檢測群特異性抗原p27為陽性,用各種特異性檢測引物進行PCR擴增,僅檢測到545bpJ亞群特異性條帶,而沒有擴增到其他的如ALV-A,ALV-B,MDV,REV等條帶。與細胞或組織超微切片方法相比較,差速離心濃縮后的病毒在電鏡下的形態(tài)更為清晰直觀。透射電鏡下SCAU11-H病毒粒子直徑為60~140nm,多近似球形,也有一些外層部分呈長桿形、鼓錘形的形態(tài)結(jié)構(gòu)。Fujita等研究指出,白血病/肉瘤病病毒(ALSV)粒子經(jīng)負染呈球形,在干燥條件易扭曲成精子狀、弦月狀或其他形狀,而其內(nèi)部類核體與外層部分相比似乎不易變形。另外,也有報道指出,病毒的異常形態(tài)結(jié)構(gòu)可能是病毒增殖過程中的某一特殊方式。對于本次試驗觀察到一些病毒異常形態(tài)結(jié)構(gòu),筆者認為可能是由于差速離心、外界溫度濕度影響或是磷酸鎢負染等其他原因?qū)е碌男螒B(tài)變化。Kolokoltsov和Reddy等分別通過超速離心濃縮經(jīng)人工改造拯救后的病毒,然后將得到的較高滴度的濃縮病毒粒子進行稀釋后用于下一步試驗。特別是針對一些低復(fù)制能力病毒的人工發(fā)病模型的試驗,病毒感染滴度將是反映其致病性的重要影響因素。本試驗通過差速離心法濃縮J亞群禽白血病分離株SCAU11-H后,發(fā)現(xiàn)濃縮前后病毒的滴度(TCID50/mL)可由原來的1.58×105/mL上升到8.89×1011/mL。從這些研究中,可以發(fā)現(xiàn)對于一些人工改造如嵌合型、缺失、突變等低復(fù)制能力病毒,或者是在細胞上繁毒周期長的慢病毒,超離濃縮將是快速提高病毒滴度的一種方法。本試驗針對ALV-J分離株SCAU11-H的env基因和雞的GAPDH的基因保守序列分別設(shè)計引物進行擴增,檢測病毒不同時間點的濃縮后病毒RNA合成水平。RT-PCR結(jié)果表明,1d、3d、5d病毒RNA合成水平逐漸增加,說明濃縮后的病毒在DF-1細胞上能正常復(fù)制。間接免疫熒光、ELI-SA檢測結(jié)果陽性,表明病毒蛋白gp85、p27正常表達,進一步說明了病毒生物學(xué)活性正常。由于J亞群禽白血病病毒對溫度敏感,超速離心所有的試驗步驟都盡量在冰上操作以避免影響其生物學(xué)活性。但因試驗操作時間和4℃離心時間均較長,確實有必要鑒定濃縮后病毒的生物學(xué)活性。ELISA、q-PCR、IFA檢測結(jié)果表明,差速離心并